王慧敏,陳還珍

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)病率在逐年上升,嚴(yán)重影響了人們的健康。研究表明,炎癥反應(yīng)對(duì)AS的形成起關(guān)鍵性的作用[1]。核因子-kappaB(nuclear factor-kappaB,NF-κ B)是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵性因子,并參與了許多與炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控。新近研究發(fā)現(xiàn),NF-κ B也存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞中,并且與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展有關(guān),NF-κ B激活后,將導(dǎo)致炎癥相關(guān)因子的過(guò)度表達(dá),引起明顯的炎癥反應(yīng)[2]。吡格列酮是一種合成的過(guò)氧化物增殖物激活型受體γ(PPARγ)激動(dòng)劑,PPAR激動(dòng)劑不僅調(diào)節(jié)代謝,而且能抑制血管的炎癥反應(yīng),具有抗 AS作用。本研究采用吡格列酮觀察對(duì)核因子-κ B表達(dá)的影響,從而為 PPARγ激動(dòng)劑抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 吡格列酮(艾可拓,日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn),天津武田藥品有限公司分裝);膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司);抗鼠NF-κ B的亞基(NF-κ Bp65)抗體(北京中杉金橋生物有限公司);膽酸鈉、膽固醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純;離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);石蠟切片機(jī)(上海市醫(yī)療器械工業(yè)公司);圖像分析儀、攝像儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 動(dòng)物和分組 30只重量為(110±10)g的健康雄性Wistar大鼠(由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分為3組,正常飲食組、高脂飲食組及高脂飲食加吡格列酮干預(yù)組。隨機(jī)取其中10只作為正常對(duì)照組,給予普通飼料喂養(yǎng) 12周;20只作為高脂飲食組,予以高脂飼料喂養(yǎng)12周。6周后隨機(jī)取10只作為高脂飲食加吡格列酮干預(yù)組,在高脂飲食基礎(chǔ)上給予吡格列酮10 mg/(kg?d)口服。

1.3 血脂和脂蛋白測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),經(jīng)鼠尾取血,禁置后,3 000 r/min離心10 min制備血清,按照試劑盒要求測(cè)定3組大鼠的血脂。

1.4 病理及免疫組化切片

1.4.1 取材 25%烏拉坦腹腔注射麻醉動(dòng)物,切開胸腹,游離胸腹主動(dòng)脈全長(zhǎng),剝離外膜脂肪組織,取一段胸腹主動(dòng)脈3 cm～5cm,生理鹽水沖洗,置于10%中性緩沖甲醛(pH=7.2)中固定。

1.4.2 病理切片圖像分析 取胸主動(dòng)脈5 mm,脫水并透明15 h,常溫下石蠟包埋,冷凍后切片。光鏡下觀察照相,用 Image Tool圖像分析儀測(cè)量?jī)?nèi)膜和肌層厚度。

1.4.3 免疫組化染色 取上述普通切片,參照免疫組化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,由北京中杉金橋生物有限公司提供抗鼠 NF-κ B的亞基 NF-κ Bp65免疫細(xì)胞化學(xué)染色,光鏡初步觀察,各組取3張切片,400倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,采用H-SCORE法計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占的比率。NF-κ Bp65陽(yáng)性染色以細(xì)胞核染色為主,細(xì)胞質(zhì)也有染色,呈棕黃色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì),對(duì)主要指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。兩樣本比較采用t檢驗(yàn),3組間比較采用One-WayANOVA分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié) 果

2.1 體重測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前 30只大鼠體重為 110 g±10 g,6周后,給予高脂飲食的大鼠,體重升至310 g±12 g;正常飲食的大鼠,體重為 205 g±10 g(P＜0.05)。12周時(shí)高脂飲食組體重增加至390g±35g顯著高于正常飲食大鼠(270g±12g,P＜0.05)。吡格列酮組體重增至332 g±20 g,與高脂正常飲食組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 血脂測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前各組血脂水平無(wú)明顯差別;12周末高脂飲食組 TC、LDL-C、TG和HDL-C均明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01);吡格列酮干預(yù)后 TC、TG、LDL-C下降,HDL-C升高,與高脂飲食組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組血脂水平變化(±s)mmol/L

表1 各組血脂水平變化(±s)mmol/L

組別 n TC TG LDL-C HDL-C正常對(duì)照組 10 2.09±0.13 0.57±0.11 1.05±0.23 0.45±0.25高脂飲食組 10 3.51±0.201) 1.56±0.261) 2.03±0.121) 0.81±0.211)吡格列酮組 10 2.73±0.162) 1.15±0.142) 1.41±0.102) 1.21±0.182)與正常對(duì)照組比較,1)P＜0.01;與高脂飲食組比較,2)P＜0.05

2.3 病理切片內(nèi)膜及肌層厚度對(duì)比 高脂組的主動(dòng)脈內(nèi)膜及 肌層厚度明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01),也明顯高于吡格列酮組(P＜0.01),與正常對(duì)照組相比,吡格列酮組內(nèi)膜及肌層增厚,也具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表2。

表2 各組病理切片內(nèi)膜及肌層厚度的對(duì)比(±s)μ m

表2 各組病理切片內(nèi)膜及肌層厚度的對(duì)比(±s)μ m

組別 n 內(nèi)膜厚度 中膜厚度正常對(duì)照組 10 8.2±1.5 53.9±6.5高脂飲食組 10 13.4±2.01)2) 92.2±8.31)2)吡格列酮組 10 9.8±2.11) 70.2±11.21)與正常對(duì)照組比較,1)P＜0.01;與吡格列酮組比較,2)P＜0.01。

2.4 主動(dòng)脈壁 NF-κ Bp65表達(dá)陽(yáng)性率比較 正常對(duì)照組動(dòng)脈壁 NF-κ Bp65陽(yáng)性率明顯低于高脂飲食組(P＜0.05),也低于吡格列酮干預(yù)組(P＜0.05);與高脂飲食組相比,吡格列酮組動(dòng)脈壁 NF-κ Bp65陽(yáng)性率明顯降低(P＜0.001)。詳見表3。

表3 各組間動(dòng)脈壁 NF-κ Bp65含量(±s)%

表3 各組間動(dòng)脈壁 NF-κ Bp65含量(±s)%

組別 n NF-κ Bp65陽(yáng)性率正常對(duì)照組 10 5.9±0.4高脂飲食組 10 76.1±1.01)吡格列酮組 10 20.1±1.21)2)與正常對(duì)照組比較,1)P＜0.05;與高脂飲食組比較,2)P＜0.001

3 討 論

近年來(lái),大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)提示炎癥機(jī)制在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用[3-5]。核因子-κ B又名核轉(zhuǎn)錄因子,是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,它對(duì)多種促炎癥細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子和生長(zhǎng)因子表達(dá)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[6]。有學(xué)者使用免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)對(duì)人類AS組織研究發(fā)現(xiàn),在AS組織中有明顯的 NF-κ B激活現(xiàn)象[7]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是AS發(fā)病過(guò)程中最先被激活的細(xì)胞,單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附、向內(nèi)皮下遷移及泡沫化在AS發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要,NF-κ B通過(guò)調(diào)控細(xì)胞黏附分子的表達(dá)而參與了單核細(xì)胞浸潤(rùn)與遷移的全過(guò)程。因此,認(rèn)為 NF-κ B是 AS發(fā)生的始動(dòng)機(jī)制之一[8]。具有抑制NF-κ B作用的藥物可能有防治AS的發(fā)生和發(fā)展作用[9]。

吡格列酮作為噻唑烷二酮(TZDs)類藥物之一,PPARγ的高選擇性、高親和性激動(dòng)劑,通過(guò)抑制血管細(xì)胞促炎基因的表達(dá)起著抗炎作用[10]。2000年以來(lái),幾項(xiàng)在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的研究表明,噻唑烷二酮類藥物可以通過(guò)改善引起動(dòng)脈粥樣硬化的代謝危險(xiǎn)因素以及減少動(dòng)脈管壁的炎性因子而減輕動(dòng)脈硬化[11,12]。Giulia等[13]證實(shí),TZDs羅格列酮可以通過(guò)抑制NF-κ B亞基p65/RelA的轉(zhuǎn)錄活性及抗凋亡的NF-κ B信號(hào)通路來(lái)減輕炎癥反應(yīng)的作用。2005年,Goldberg等[14]對(duì) 802例合并有脂質(zhì)代謝障礙的2型糖尿病患者研究發(fā)現(xiàn),與羅格列酮相比,吡格列酮具有明顯的降低三酰甘油和低密度脂蛋白濃度、增加高密度脂蛋白膽固醇濃度,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。支持吡格列酮對(duì)心血管起保護(hù)作用觀點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HE染色觀察到吡格列酮能減輕動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜和肌層增厚,證實(shí)了它的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。通過(guò)采用免疫組化染色表明,動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈大量表達(dá)核因子-κ B,而吡格列酮能顯著抑制它的表達(dá),從而抑制促炎基因的表達(dá),使炎癥因子、細(xì)胞因子、黏附分子等生成減少。PPARγ激活后還能與轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)等以非DNA結(jié)合方式相互作用,通過(guò)抑制炎癥基因發(fā)揮抗炎特性,即轉(zhuǎn)錄抑制[15]。對(duì)NF-κ B進(jìn)行深入研究將會(huì)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防、診斷、治療產(chǎn)生積極影響,有望成為抗動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)。

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