李 芳,楊志明,肖傳實,康玉明

動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展是一個極其復雜的病理生理過程,血脂代謝紊亂與其密切相關,血漿脂質水平升高可促使大量脂質尤其是膽固醇進入動脈壁,最終導致AS病變形成。膽固醇逆轉運(RCT)過程對機體具有抗AS的保護作用。SR-B1是一種高密度脂蛋白(HDL)生理性相關受體,是第一個在分子水平上得到證實的HDL受體。已有研究證實,RCT過程中包括細胞膽固醇的流出等關鍵步驟均需SR-B的參與[1]。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)參與了AS的發(fā)生過程。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要活性成分,是一種加速AS成的重要危險因子[2]。Wolf等[3]的研究首次發(fā)現(xiàn),AngⅡ能下調近端腎小管細胞SR-B1的表達。有關AngⅡ對巨噬細胞SRB1表達的影響尚未見報道。本研究擬以THP-1源性巨噬細胞為對象,觀察AngⅡ對THP-1源性巨噬細胞SR-B1表達的影響,探討AngⅡ促進AS的新機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人THP-1單核細胞(購自中科院上海細胞庫);AngⅡ、佛波脂(PMA)均為美國 Sigma公司產品;RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國GIBCO/BRL公司);總 RNA提取試劑盒(Trizol)美國Promega公司;SR-BI引物、β-actin引物(內參)大連寶生物有限公司;胎牛血清(杭州四季青公司);兔抗人SR-B1多克隆抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 THP-1細胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),在每次實驗前用160 nmol/L PMA孵育 THP-1細胞 36 h,使其誘導分化成巨噬細胞。分組并計數,實驗共分5組,即對照組(AngⅡ0 nmol/L)、AngⅡ10 nmol/L、AngⅡ100 nmol/L、AngⅡ1000 nmol/L、AngⅡ10000 nmol/L,各組作用24 h后收集細胞,用于SR-B1表達的檢測。

1.2.2 RT-PCR法檢測THP-1巨噬細胞SR-B1mRNA表達T rizol法提取總RNA,SR-B1表達水平以目的mRNA與內參照人β-actin灰度值之比表示。引物序列由大連寶生物有限公司合。人THP-1巨噬細胞SR-B1引物序列,上游引物:5'-ctgtgggtgagatcatgtgg-3',下游引物:5'-gttccacttgtccacgaggt-3',擴增片段 191bp;人β-actin引物序列,上游引物:5'-tgaacgggaagctcactgg-3',下游引物:5'-tccaccaccctgttgctgga-3',擴增片段為307bp。取各組細胞總 RNA 2 μ g反轉錄合成 cDNA,再取反轉錄產物1 μ L進行PCR循環(huán)。反應結束后,取反應產物5 μ L進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳,溴乙啶染色,UVP凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描攝圖分析。

1.2.3 Western-blot蛋白印跡法檢測THP-1巨噬細胞 SR-B1蛋白表達 用細胞裂解液裂解細胞,取總蛋白50 μ g進行變性,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2 結 果

2.1 巨噬細胞的分化鑒定 細胞呈圓形、懸浮生長,經160 nmol/LPMA誘導分化36 h后,細胞停止增殖,由懸浮生長變?yōu)橘N壁生長,且伸展偽足,呈巨噬細胞外形。

2.2 THP-1巨噬細胞SR-B1表達的檢測 THP-1巨噬細胞與不同濃度 AngⅡ(對照組 0 、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L、10 000 nmol/L)孵育24 h后,RT-PCR檢測 T HP-1巨噬細胞SR-B1mRNA的表達。結果顯示,與對照組相比,AngⅡ使THP-1巨噬細胞SR-B1mRNA的表達下調,且呈劑量依賴關系(P＜0.05)。詳見表1。

Western印跡方法檢測各組細胞SR-BI蛋白質的表達。結果顯示,與對照組相比,AngⅡ使THP-1巨噬細胞SR-B1蛋白質的表達下調,且呈劑量依賴關系(P＜0.05)。詳見表2。

表1 各組 THP-1源巨噬細胞SR-B1 mRNA表達(±s)

表1 各組 THP-1源巨噬細胞SR-B1 mRNA表達(±s)

組別 n SR-B1對照組 6 0.86±0.05 10 mmol/L組 6 0.65±0.071)100 mmol/L組 6 0.47±0.031)1 000 mmol/L組 6 0.35±0.031)10 000 mmol/L組 6 0.24±0.031)與對照組相比,1)P＜0.05

表2 各組 THP-1源巨噬細胞SR-B1蛋白表達(±s)

表2 各組 THP-1源巨噬細胞SR-B1蛋白表達(±s)

組別 n SR-B1對照組 6 1.17±0.04 10 mmol/L組 6 0.89±0.021)100 mmol/L組 6 0.77±0.021)1 000 mmol/L組 6 0.61±0.021)10 000 mmol/L組 6 0.49±0.021)與對照組相比,1)P＜0.05

3 討 論

冠心病是人類排列前位的主要致死原因,國際著名的七國研究、美國弗萊明漢心臟研究和多危險因素干預試驗(MRFTI)均證實血漿膽固醇水平的升高是冠心病發(fā)生率、死亡率增高的最重要危險因素。研究SR-B1缺失的小鼠發(fā)現(xiàn),不僅肝臟選擇性攝取膽固醇降低,AS損傷加劇,而且動物易發(fā)冠心病并伴隨自發(fā)的心肌梗死、心力衰竭和死亡[4]。巨噬細胞SR-B1的表達對apoE-/-小鼠體內的動脈粥樣硬化病變的進展有保護作用[5]。因此SR-B1的表達調控可能在AS的形成中起重要作用,如何調控SR-B1成為人們關注的焦點。研究證實,SR-B1在肝臟細胞、類固醇激素生成細胞或巨噬細胞的表達可因給予雌激素,過氧化物酶體增殖物活化受體拮抗劑、維生素E、多聚不飽和脂肪酸、膽固醇等而改變[6],然而對AS的形成與發(fā)展起重要促進作用的AngⅡ是否對SR-B1表達有調控作用尚不清楚。

本實驗顯示,AngⅡ能顯著抑制巨噬細胞SR-B1mRNA的表達,并呈劑量依賴性(P＜0.05)。同樣AngⅡ能顯著抑制巨噬細胞SR-B1蛋白的表達,且呈劑量依賴性(P＜0.05),并且其蛋白表達水平同mRNA表達水平一致。

本研究結果顯示,AngⅡ對T HP-1源性巨噬細胞SR-B1具有負性調控作用。因此AngⅡ促進AS的一個重要機制就是通過抑制SR-B1的表達,從而使巨噬細胞膽固醇逆轉運受阻,導致動脈粥樣硬化病變形成。

[1]Acton SL,Kozarsky KF,Rigotti A.The HDL receptor SR-B1:A new therapeutic target for atherosclerosis[J].Molecular Medicine Today,1999,5:518-524.

[2]Gorte K,Drexler H,Schieffer B.Rennin agiotensin systemn and atherosclerosis[J].NePhrol Dial Transplant,2004,19(4):770-773.

[3]Wolf G,Wenezl U,Jablonski K,et al.AngioetnsinⅡdown-regulates SR-B1 HDL receptor in proximal tublar cells[J].NePhrol Dial T ransplant,2005,20(6):1222-1227.

[4]Trigatti B,Covey S,Rizvi A.Scavenger receptor class B ty pe I in high-density lipoprotein metabolism,atherosclerosis and heart disease:Lessons from gene-targeted mice[J].Biochem Soc Trans,2004,32P(t1):116-120.

[5]Zhang W,Yancey PG,Su YR,et al.Inactivation of macrophage scavenger receptor class B ty pe I promotes atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice[J].Circulation,2003,108(18):2258-2263.

[6]Krieger M.Charting the fate of the“ good cholesterol” :Identification and characterization of the high-density lipoprotein recepto r SR-B1[J].Annu Rev Biochem,1999,68:523-558.