王建華,劉瑞珍

腦缺血/再灌注損傷與程序性細(xì)胞死亡密切相關(guān)[1],近年來人們對凋亡的認(rèn)識已經(jīng)從細(xì)胞核的改變決定凋亡,發(fā)展為重視線粒體,因為它構(gòu)成細(xì)胞存亡的控制中心,在線粒體依賴性細(xì)胞凋亡途徑中,細(xì)胞色素-C(Cyt-C)從線粒體內(nèi)膜腔釋放到胞漿是凋亡過程的重要環(huán)節(jié)。研制細(xì)胞凋亡的有效抑制劑,可為改善缺血性腦血管患者的預(yù)后提供較好的幫助。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物與儀器 健康雄性Wistar大鼠180只,體重200 g～250 g,由山西醫(yī)科大學(xué)生理實驗室提供,丁苯酞膠囊由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供(批號:08100111)。Cyt-C,TUNEL原位檢測試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供;PM-10AD光學(xué)顯微鏡(Olympus optical Co.Ltd,JAPAN),BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)由山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室提供。

1.2 分組與給藥 180只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=36),模型組(n=36),丁苯酞治療組(n=36),丁苯酞預(yù)防組(n=36),丁苯酞預(yù)防加治療組(n=36),每組再分為缺血再灌注6 h,12 h,24 h 3個亞組。丁苯酞給藥計量為80 mg/kg。假手術(shù)組與模型組于缺血2 h后腹腔注射同體積生理鹽水;丁苯酞治療組于缺血2 h后腹腔注射丁苯酞稀釋液;丁苯酞預(yù)防組采用手術(shù)前一周連續(xù)灌胃給藥,每日一次,手術(shù)當(dāng)天不給藥;丁苯酞預(yù)防加治療組采用術(shù)前一周連續(xù)灌胃給藥,缺血2 h后腹腔注射給藥一次。

1.3 模型的制備 所有大鼠均按Zea Longa方法栓塞右側(cè)大腦中動脈,分別于缺血再灌注 6 h、12 h、24 h取材。期間在大鼠清醒時進(jìn)行神經(jīng)功能缺失體征評分,1分～3分為造模成功隨機(jī)補(bǔ)充。

1.4 檢測方法與步驟

1.4.1 HE染色觀察腦組織病理形態(tài) 大鼠麻醉,用內(nèi)固定的方法取全腦。將腦組織從前向后切取2張厚3 μ m的冠狀切片置于載玻片上,后常規(guī)脫蠟,HE染色,封片,最后光鏡觀察。

1.4.2 免疫組化測Cyt-C 常規(guī)脫蠟,在3%H2O2中浸泡15 min,蒸餾水浸泡3 min后0.1 mmol/L PBS緩沖液洗滌2 min,3次,高壓修復(fù)2 min,自然冷卻至30℃以下時0.1 mmol/L PBS緩沖液洗滌2 min,3次,滴加一抗(按1:200稀釋)100 μ L,4℃冰箱過夜,室溫放置30 min后0.1 mmol/L PBS緩沖液洗滌2 min×3次,滴加二抗 100 μ L,37 ℃烤箱置 20 min,室溫置 20 min,0.1 mmol/L PBS緩沖液洗滌2 min,3次,生物素過氧化物酶(DAB)顯色,取蒸餾水 1 mL,加 DAB試劑盒中的 A,B,C試劑各一滴,混勻后加至切片。顯微鏡下觀察Cyt-C蛋白表達(dá)情況。采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng),測量Cyt-C染色陽性細(xì)胞的平均灰度值。

1.4.3 T UNEL法測凋亡細(xì)胞 根據(jù)試劑盒指導(dǎo)步驟完成實驗,顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。每張切片在10×25倍下隨機(jī)選取不重疊的5個視野,計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(胞核呈棕黃色顆粒)。

2 結(jié) 果

2.1 病理改變 假手術(shù)組缺血側(cè)腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞密度大,無明顯水腫,模型組缺血側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)較疏松,間質(zhì)水腫,部分細(xì)胞消失,有散在空腔形成,且出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元變性、壞死,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯減少,胞體縮小,胞核形態(tài)不規(guī)則,輪廓模糊。治療組、預(yù)防治療組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,病理改變輕微,個別神經(jīng)元變性、壞死。

2.2 免疫組化Cyt-C表達(dá) 假手術(shù)組呈弱陽性表達(dá),模型組缺血再灌注后6 h Cyt-C強(qiáng)陽性表達(dá),之后陽性表達(dá)逐漸減弱,表達(dá)區(qū)域主要集中在海馬區(qū)。丁苯酞治療組缺血再灌注后6 h、12 h、24 h Cyt-C表達(dá)較弱,與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);預(yù)防組與模型組比較Cyt-C表達(dá)有差異;預(yù)防加治療組與治療組比較Cyt-C表達(dá)弱。詳見表1。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后Cyt-C表達(dá)比較(±s)

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后Cyt-C表達(dá)比較(±s)

組別 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術(shù)組 12 133.57±0.92 133.82±1.20 133.98±0.77模型組 12 102.96±0.961) 108.59±1.201) 116.89±0.691)治療組 12 126.03±1.443) 129.58±1.103) 131.07±1.093)預(yù)防組 12 104.53±1.132) 110.22±1.072) 118.11±1.242)預(yù)防加治療組 12 127.75±1.634) 131.00±0.584) 132.58±0.954)假手術(shù)組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05;3)P＜0.01;與治療組比較,4)P＜0.05

2.3 TUNEL檢測結(jié)果 假手術(shù)組凋亡細(xì)胞少量表達(dá);模型組各時間點凋亡細(xì)胞表達(dá)較多,主要集中在海馬區(qū),與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),以缺血再灌注后6 h凋亡細(xì)胞最多;丁苯酞治療組凋亡細(xì)胞表達(dá)數(shù)較模型組少(P＜0.01);預(yù)防組與模型組比較凋亡細(xì)胞數(shù)有差異(P＜0.05);預(yù)防治療組與治療組比較凋亡細(xì)胞少量表達(dá)(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡數(shù)比較(±s)個

表2 各組大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡數(shù)比較(±s)個

組別 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術(shù)組 12 3.00±0.89 3.00±0.63 3.00±0.89模型組 12 36.17±3.551) 30.00±2.821) 28.83±3.551)治療組 12 22.17±3.193) 20.67±2.073) 19.17±2.643)預(yù)防組 12 33.00±2.612) 27.67±2.162) 25.83±3.062)預(yù)防加治療組 12 18.67±1.864) 17.83±1.724) 15.50±2.434)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01;與治療組比較,4)P＜0.05

3 討 論

研究認(rèn)為各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中,線粒體功能障礙導(dǎo)致Cyt-C從線粒體膜間隙釋放是普遍現(xiàn)象。Cyt-C是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體,它的缺失或功能障礙將會導(dǎo)致線粒體呼吸鏈出現(xiàn)功能異常,結(jié)果A TP缺乏,而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。目前多數(shù)人認(rèn)為Cyt-C要通過兩條途徑引起細(xì)胞凋亡:一方面,凋亡過程中Cyt-C通過線粒體外膜釋放,在ATP/dATP的參與下,在胞質(zhì)中與Apaf-1結(jié)合形成寡聚體,Apaf-1通過其氨基端和procaspase9的功能前區(qū)相互作用,導(dǎo)致caspase3激活,并進(jìn)一步激活下游的caspases,從而將細(xì)胞凋亡的信息傳遞下去;另一方面是caspases非依賴途徑,Cyt-C缺乏時,ATP合成減少及不完全氧化造成的超氧陰離子(ROS)過度生成,它能使脂質(zhì)發(fā)生過氧化、DNA氧化修飾、蛋白質(zhì)氧化和酶的失活,這些損害最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。

丁苯酞在基礎(chǔ)與臨床研究中已被證明可以阻斷急性缺血性腦損傷的多個病理環(huán)節(jié),從而改善腦梗死的神經(jīng)功能缺損癥狀。但其對缺血再灌注損傷的預(yù)防作用國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究,預(yù)防效果不得而知。然而近期國外有多篇關(guān)于對缺血再灌注損傷進(jìn)行藥物或其他方法預(yù)防治療的文獻(xiàn)報道,且證實了對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用,并提出了幾種可能作用機(jī)制[3-5]。

本實驗中大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)較疏松,間質(zhì)水腫,有散在空腔形成,出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元變性、壞死,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯減少。Cyt-C蛋白在缺血再灌注6 h組中表達(dá)最強(qiáng),同時凋亡細(xì)胞計數(shù)最多,隨著缺血再灌注時間的延長,Cyt-C陽性表達(dá)逐漸減弱,凋亡細(xì)胞數(shù)減少,給予丁苯酞治療后3個時間點Cyt-C表達(dá)均較模型組減弱,凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少,組織病理改變顯著好轉(zhuǎn),證明丁苯酞能夠有效抑制Cyt-C從線粒體的釋放,阻斷細(xì)胞凋亡信號的傳導(dǎo),從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生,修復(fù)缺血后神經(jīng)元的損傷。丁苯酞預(yù)防組與模型組、丁苯酞預(yù)防加治療組與丁苯酞治療組比較,Cyt-C表達(dá)減弱,凋亡細(xì)胞減少,證明丁苯酞預(yù)防也可能通過減少Cyt-C釋放起到神經(jīng)保護(hù)作用,但其確切機(jī)制及Cyt-C與其他調(diào)控基因間的作用有待進(jìn)一步研究。結(jié)合目前國內(nèi)外對腦缺血再灌注損傷的預(yù)防研究,本實驗顯示抑制Cyt-C釋放的同時有一定的預(yù)防保護(hù)作用,但丁苯酞預(yù)防與治療的起始作用靶點、作用途徑、最終效果等是否一致仍無法證實,需要進(jìn)一步研究。

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