陳國蕾,梁新華,焦 炎

低氧誘導因子(HIF-1)是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的缺氧感受因子,由α、β兩個亞基組成,其中α既是調(diào)節(jié)亞基,又是活性亞基。常氧條件下,哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心 肺、胎盤、骨骼肌和腎等組織內(nèi)均有HIF-1α的表達,但含量很低,難以檢測,但當細胞缺血缺氧時,HIF-1α表達就開始增高,作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,其介導多種效應(yīng)基因的表達,在缺血缺氧反應(yīng)過程發(fā)揮重要作用[1,2]。本實驗旨在通過對腦挫傷后不同時間段HIF-1α的表達進行檢測,建立HIF-1α的表達與腦挫傷經(jīng)過時間的關(guān)系,為法醫(yī)學腦挫傷經(jīng)過時間的推斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康成年SD大鼠64只(山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供),體重(250±10)g,雌雄不限,隨機分為8組,分別為對照組和挫傷后1 h組、4 h組、12 h組、48 h組、72 h組、7 d組、14 d組,每組 8只。

1.2 腦挫傷模型的建立及取材 參照Feeney法建立大鼠閉合性腦挫傷模型。大鼠稱重后,3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉,大鼠腦立體定位儀固定大鼠頭部,沿正中線切開頭頂部皮膚,在人字縫前方3 mm、顱骨中線旁3 mm處,鉆直徑5 mm的圓形骨窗。保持硬腦膜完整,在硬腦膜上放置墊片,采用自由落體打擊裝置,以50 g重錘從20 cm高處垂直下落打擊一次,縫合皮膚,術(shù)后常規(guī)進飲食。分別于傷后1 h、4 h、12 h、48 h、72 h、7 d、14 d頸椎脫臼處死動物,開顱,以腦挫傷灶為中心旁開1 mm行大鼠腦冠狀切面取材,置于4%多聚甲醛PBS液中固定,對照組動物直接處死,相同部位取材。

1.3 方法 甲醛中取出組織,常規(guī)酒精梯度脫水,石蠟包埋,切片(厚度4 μ m),石蠟切片脫蠟至水,常規(guī)行 HE染色,免疫組化SABC法操作步驟參照試劑盒說明書進行,3%H2O2滅活內(nèi)源性酶,PBS沖洗;微波抗原修復,PBS沖洗;5%小牛血清封閉,一抗稀釋度為 1∶100,4℃,過夜,PBS沖洗;二抗37℃,45 min;PBS沖洗;滴加SABC,0.5 h,PBS沖洗;DAB鏡下控制顯色,水洗,蘇木素復染細胞核,脫水,透明,封片。用PBS取代一抗作陰性對照,以細胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色產(chǎn)物為陽性結(jié)果。兔HIF-1α IgG多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。運用BI-2000圖像分析系統(tǒng),在腦挫傷區(qū)周圍隨機選取5個高倍視野(×200),以損傷部位周圍出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng),進行陽性細胞計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間差異比較采用t檢驗和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果 對照組神經(jīng)元細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,核染色較淡、圓形,核仁清楚;損傷組可見腦實質(zhì)散在出血,蛛網(wǎng)膜下腔、側(cè)腦室出血。所選切面各部位均可見程度不一的神經(jīng)元細胞核深染、固縮,神經(jīng)元細胞水腫,周圍出現(xiàn)空隙,逐漸發(fā)展為胞核破碎溶解,神經(jīng)元壞死消失,周圍膠質(zhì)細胞增生。

2.2 HIF-1α免疫組織化學染色 傷后1 h即可觀察到陽性反應(yīng)細胞,呈散在少量分布,陽性產(chǎn)物呈棕黃色,主要位于神經(jīng)細胞胞核及胞漿內(nèi)。對照組神經(jīng)細胞偶見HIF-1α表達。傷后12 h可見表達HIF-1α的神經(jīng)細胞數(shù)增多,表達強度增強,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);48 h后達高峰,陽性細胞聚集成簇,周圍可見大量棕黃色產(chǎn)物。隨后陽性反應(yīng)細胞逐漸減少,7 d后仍見少量表達,14 d后基本恢復正常。詳見表1。組別 n 陽性細胞數(shù)

表1 腦挫傷后不同時間段HIF-1α陽性細胞計數(shù)(±s)個

表1 腦挫傷后不同時間段HIF-1α陽性細胞計數(shù)(±s)個

對照組 8 2.1±1.4 1 h組 8 12.7±2.11)4 h組 8 20.4±2.51)2)12 h組 8 48.8±3.91)2)48 h組 8 109.3±11.51)2)72 h組 8 77.5±4.71)2)7 d組 8 14.8±2.91)2)14 d組 8 3.4±1.42)與對照組比較,1)P＜0.05;與上一組比較,2)P＜0.05

3 討 論

腦組織細胞對缺血缺氧極為敏感,腦挫傷常會損傷血管神經(jīng),破壞腦血循環(huán)的調(diào)節(jié)功能,造成血流變慢,組織缺氧,細胞壞死,引發(fā)各種功能障礙。對腦挫傷的調(diào)節(jié)機制進行研究,發(fā)現(xiàn)多種酶、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子及相關(guān)蛋白在腦挫傷的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3-5]。HIF-1作為一種隨氧濃度變化而調(diào)節(jié)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子,HIF-1α表達增加是缺血缺氧早期首發(fā)的分子水平的適應(yīng)性反應(yīng),它作為調(diào)節(jié)基因蛋白,可以促進許多效應(yīng)基因的表達,介導與缺氧有關(guān)的各種應(yīng)激反應(yīng)[6-8]。國內(nèi)外很多學者對HIF-1α在腦挫傷的表達機制及調(diào)節(jié)機制做了深入研究,發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以誘導其靶基因如促紅細胞生成素、糖酵解酶、誘導型一氧化氮合酶和血管內(nèi)皮生長因子等激活,從而參與氧氣運輸、能量代謝、血管構(gòu)建和細胞分化等機體的自我保護反應(yīng)[9-11]。

本實驗通過模擬人的閉合性腦挫傷模型,采用免疫組化的方法對HIF-1α蛋白表達進行觀測,結(jié)果顯示HIF-1α表達主要分布于皮層、海馬和腦干,可能與這些部位對缺氧更為敏感有關(guān),在腦挫傷后1 h即可檢測到少量 HIF-1α蛋白表達,到 4 h時,HIF-1α蛋白表達開始增強,至48 h達高峰,7 d后仍有少量表達,14 d后恢復正常。蘇莉等[12]通過制作彌漫性腦損傷模型對HIF-1α的變化規(guī)律進行研究,免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)彌漫性腦損傷后1 h～2 h可在皮質(zhì)、丘腦和腦干等部位觀察到HIF-1α增多,12h達高峰,24h減弱。這與本實驗研究結(jié)果有一定差異,可能是由于實驗方法的不同,形成的損傷程度不同造成的。但兩者都表現(xiàn)出先逐漸升高,達到峰值后又逐漸下降的趨勢。本次實驗結(jié)果分析原因可能為:腦挫傷早期,腦組織缺血缺氧所致的氧化應(yīng)激可以誘導HIF-1α的表達升高,但是由于基因的表達需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程,所以早期HIF-1α的表達不明顯,隨著時間的延長,HIF-1α的降解途徑阻斷以及基因表達持續(xù)增加,所以在48 h時達到一個高峰,隨后由于組織細胞自我修復以及對缺血缺氧的耐受,HIF-1α的表達逐漸下降直至恢復正常。綜上所述,HIF-1α的表達有一定的時間規(guī)律性,但是由于損傷程度的差異,單純通過對其表達量的檢測來推斷損傷時間是不可靠的,應(yīng)結(jié)合其他的形態(tài)學改變,以期得到更為可信的結(jié)果。

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