郭文平,梁新華,焦 炎

創(chuàng)傷性顱腦損傷作為現(xiàn)實(shí)生活中造成人類死亡的主要原因之一,是醫(yī)學(xué)研究的重要課題,對(duì)傷后時(shí)間的推斷也是備受法醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。細(xì)胞核因子(NF-κ B)廣泛存在于各類細(xì)胞中,在機(jī)體感染,創(chuàng)傷后的免疫,炎癥及細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,參與多種炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控,且在機(jī)體創(chuàng)傷早期即有表達(dá)。本研究通過(guò)建立大鼠腦挫傷模型,應(yīng)用免疫組化SABC法,從蛋白分子水平研究大鼠腦挫傷后不同時(shí)間NF-κ B表達(dá)與損傷經(jīng)過(guò)時(shí)間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 64只健康成年 Wistar大鼠,雌雄不限,體重250 g±10 g,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(56只)與對(duì)照組(8只),實(shí)驗(yàn)組根據(jù)損傷時(shí)間的不同分成7個(gè)小組,即挫傷后1 h組、4 h組、12 h組、48 h組、72 h組、7 d組、14 d組,每組 8只。

1.2 動(dòng)物模型制備 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物參照Feeney's法建立大鼠腦挫傷模型。大鼠稱重后,3%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉,大鼠腦立體定位儀固定大鼠頭部,正中切開(kāi)頂部頭皮,在人字縫前方3 mm、顱骨中線旁3 mm處,鉆直徑5 mm的圓形骨窗。保持硬膜完整,采用自由落體打擊裝置,以40 g重錘從20 cm高處下落打擊。術(shù)后動(dòng)物常規(guī)進(jìn)食飲食。在各分組時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,4%多聚甲醛心臟灌流后取腦組織。對(duì)照組依上述方法鉆孔后直接處死后4%多聚甲醛心臟灌流。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 將固定好的腦組織用蔗糖PBS液梯度脫水后,用LEICA CM1850超薄切片機(jī)在損傷部位范圍內(nèi)作連續(xù)冰凍切片(厚度為 5 μ m)。一抗為兔抗鼠 NF-κ B單克隆抗體(購(gòu)于武漢博士德生物工程公司),工作濃度為1∶200,用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照,免疫組織化學(xué)染色試劑盒為武漢博士德生物工程公司(貨號(hào)SA1022),染色步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。DAB(武漢博士德生物工程公司)顯色,蘇木素復(fù)染,酒精脫水、透明、封片,顯微鏡觀察并拍照。

1.4 圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用BI-2000圖像分析系統(tǒng),在腦挫傷區(qū)周圍隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400),以損傷部位周圍出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng),進(jìn)行NF-κ B免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間差異比較采用t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色觀察 損傷后1 h在挫傷區(qū)即可見(jiàn)極少量NF-κ B表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞,棕色顆粒分布于細(xì)胞核周圍及胞漿,呈圓形或橢圓形;損傷后4 h可見(jiàn)大量陽(yáng)性細(xì)胞較1 h增多;損傷后12 h損傷局部的免疫陽(yáng)性反應(yīng)較傷后4 h明顯增強(qiáng),棕黃色顆粒增多,呈叢狀或簇狀聚集,染色加深,免疫反應(yīng)范圍增大達(dá)到高峰;損傷后 48 h～72 h NF-κ B表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)逐漸減少且染色變淡,范圍也逐漸縮小;7 d時(shí)仍可見(jiàn)少量陽(yáng)性顆粒表達(dá),直至損傷后14 d基本恢復(fù)至正常水平。

2.2 NF-κ B表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞免疫組化染色圖像分析結(jié)果大鼠腦挫傷后1 h NF-κ B表達(dá)即開(kāi)始逐漸增多且隨著腦損傷后時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),12 h達(dá)到高峰,隨后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少,直到14d時(shí)仍有表達(dá)且高于對(duì)照組。除14 d組外,其余各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 腦挫傷后NF-κ B陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s)個(gè)

表1 腦挫傷后NF-κ B陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s)個(gè)

組別 鼠數(shù)(只)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)對(duì)照組 8 4.25±0.14 1 h組 8 22.15±2.701)2)4 h組 8 51.20±4.521)12 h組 8 58.61±1.671)48 h組 8 29.22±1.591)2)72 h組 8 20.10±2.461)2)7 d組 8 17.11±2.841)14 d組 8 6.10±0.542)與對(duì)照組比較,1)P＜0.05;與上組比較,2)P＜0.05

3 討 論

核轉(zhuǎn)錄因子是1986年由Bltimore和Rwiansen發(fā)現(xiàn)的。他們?cè)诔墒霣細(xì)胞和漿細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)這種蛋白能與免疫球蛋白κ輕鏈內(nèi)含增強(qiáng)子的特異性序列結(jié)合,故而命名NF-κ B。事實(shí)上,在后來(lái)的研究證實(shí)它在機(jī)體的所有細(xì)胞中存在,是一個(gè)由復(fù)雜的多肽亞單位組成的蛋白家族,目前發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常見(jiàn)中主要有 p65(RelA),p50/p105(NF-κ B1)[1]。本實(shí)驗(yàn)選取亞基p65為研究目標(biāo)。

NF-κ B二聚體與其抑制蛋白IkB結(jié)合成三聚體以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞中。在細(xì)胞受刺激后,由信號(hào)誘導(dǎo)激活I(lǐng)kB激酶(IkBkinase,IKK)使制蛋白IkB脫磷酸化。IkB激酶是NF-κ B活化的主要限速酶,IKK的活性與NF-κ B活性密切相關(guān),IKK的活性有微小下降會(huì)引起IkB降解大幅減少,導(dǎo)致NF-κ B活性降低。抑制蛋白IkB脫磷酸化與降解使NF-κ B暴露出核定位信號(hào)(nuclear localization singal,NLS),進(jìn)而介導(dǎo)位于胞漿的NF-κ B通過(guò)核孔復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi)后才參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[2,3]。此激活過(guò)程可在細(xì)胞受刺激后數(shù)分鐘內(nèi)完成。激活細(xì)胞內(nèi)NF-κ B有細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等。本實(shí)驗(yàn)觀察到NF-κ B的表達(dá)水平:陽(yáng)性細(xì)胞以大腦皮質(zhì)、杏仁核、海馬等部位為著。損傷后1 h即有NF-κ B蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn),4 h后表達(dá)明顯增多,12 h達(dá)到高峰,在48 h后逐漸減少,7 d時(shí)仍有一定量細(xì)胞高于對(duì)照組,14 d后基本恢復(fù)至接近對(duì)照組水平。除14 d組外其余不同時(shí)間段神經(jīng)元NF-κ B陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組之比較均有明顯差異。這表明損傷后NF-κ B表達(dá)可快速上升,并在12 h～48 h內(nèi)達(dá)到峰值,7 d以后接近至正常水平。腦挫傷后NF-κ B可作為一種快速反應(yīng)性蛋白誘導(dǎo)而增高,亦參與對(duì)損傷的神經(jīng)元進(jìn)行修復(fù)和保護(hù)作用[4,5]。因?yàn)镹F-κ B預(yù)先存在于胞漿中,在處于應(yīng)激狀態(tài)下就可以不用合成新的蛋白立即參與調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的基因表達(dá)。多種致炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)等作為NF-κ B的激活物活化細(xì)胞漿內(nèi)的NF-κ B后,誘導(dǎo)TNF-α、IL-1等的基因轉(zhuǎn)錄,使 TNF-α、IL-1的表達(dá)和釋放增多,而后兩者又可使 NF-κ B活化,如此往復(fù)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。因此大鼠腦挫傷后短時(shí)間內(nèi)NF-κ B即可迅速上升而達(dá)高峰。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果所顯示的NF-κ B表達(dá)呈現(xiàn)的時(shí)序性與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道相一致。

NF-κ B表達(dá)在腦挫傷后短時(shí)間內(nèi)迅速升高,經(jīng)歷了一個(gè)先逐漸增加到峰值后又恢復(fù)到接近正常水平的過(guò)程。其表達(dá)規(guī)律與損傷時(shí)間有一定的相關(guān)性,尤其是在腦損傷后48 h內(nèi)達(dá)到最高峰。在最近幾年里,很多學(xué)者對(duì)NF-κ B進(jìn)行大量的研究,以期利用它表達(dá)規(guī)律的時(shí)序性作為腦損傷時(shí)間推斷的指標(biāo)之一,但目前在腦損傷12 h內(nèi)仍沒(méi)有取得突破性進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),且樣本量有限,因而 NF-κ B成為今后臨床法醫(yī)學(xué)推斷早期腦損傷時(shí)間的客觀指標(biāo)還得進(jìn)一步研究。

[1]唐群,熊平,金秀文.核轉(zhuǎn)錄因子-κ B及其在創(chuàng)傷性腦損傷后的作用[J].中國(guó)核醫(yī)學(xué)雜志,2006,21(1):42-44.

[2]Kalla R,Liu Z,Xu S,et al.Microglia and the early phase of immune surveillance in the axotomized facial motor nucleus:Impaired microglialactivation and lymphocy te recruitment but no effect on neuronal survival or ax onal regeneration in macrophage-colony stimulating factor-deficient mice[J].J Comp Neurol,2001,436(2):182-201.

[3]Wilcockson DC,Campbell SJ,Anthony DC,et al.The sy stemic and local acute phase response following acute brain injury[J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22(3):318-326.

[4]Bhakar A L,Tannis LL,Zeindler C,et al.Constitutive nuclear factor-κ B activity is required for central neuron survival[J].J Neurosci,2002,22(19):8466-8475.

[5]Morrison B,Eberwine JH,Meaney DF,et al.Traumatic injury induces differentail experssion of cell death genes in o rganaty pic brain slice culture determined by complementary DNA array hybridization[J].Nuroscince,2000,96(1):131-139.