王曉靜,吳華璞,李子廣,郭道華

缺血性腦血管病(ICVD)是威脅人類健康與生存的主要疾病之一,治療中重建血流或增強血供是損傷修復的必需條件,但同時帶來的再灌注損傷也備受關(guān)注。細胞信號轉(zhuǎn)導在腦缺血再灌注損傷中的作用日趨受到重視,其中尤以絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導通路研究最為透徹。姜黃為姜科姜黃屬植物的干燥根莖,姜黃素(curcumin,Cur)為姜黃的主要活性成分之一,因其毒副反應(yīng)小,現(xiàn)廣泛用作色素、食品添加劑及調(diào)味品。研究表明姜黃素具有抗炎、抗氧化、清除自由基、防癌抗癌、保肝護腎等藥理學作用[1-5],并可通過多種機制抗缺血再灌注損傷,用于重要器官缺血性疾病的治療。本研究通過建立大鼠局灶性腦缺血實驗?zāi)Ｐ?檢測M APK信號轉(zhuǎn)導通路三大成員細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、C-Jun氨基末端(JNK)及p38MAPK的表達,觀察姜黃素抗腦缺血再灌注損傷作用與MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑 姜黃素:BIOMOL公司產(chǎn)品;溶媒(DMSO):宜興市展望化工試劑廠生產(chǎn),批號:020822,DMSO助溶配制成0.4%的姜黃素溶液;尼莫地平(nimodipine,Nim)注射液:德國拜耳醫(yī)藥保健股份公司產(chǎn)品;兔多抗p38MAPK,鼠單抗 p-p38MAPK,兔多抗 ERK1、ERK2,鼠抗人β-action,山羊抗兔IgG,山羊抗鼠IgG:中杉金橋生物技術(shù)有限公司;鼠抗人p-ERK1/2:Santa Cruz公司;兔多抗C-Jun protein:北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,普通級,體重250 g～280 g,蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.3 大鼠局灶性腦缺血模型制備及實驗分組 SD大鼠84只,隨機分為 7組,每組12只,分別為假手術(shù)(SH)組、缺血再灌注(I/R)組、尼莫地平(0.4 mg/kg)組、姜黃素(20 mg/kg、40 mg/kg、80mg/kg)組及DMSO組,其中6只用于神經(jīng)行為學評分,另6只用于Western blot檢測。參照Longa法[6]稍加改進制作大鼠相應(yīng)中動脈(MCAO)試驗?zāi)Ｐ?。分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)及翼顎動脈(ICA分支),結(jié)扎ECA后,在其近心端剪一小口,用直徑0.2 mm尼龍線經(jīng)小口插入,經(jīng)分叉處輕推入ICA。當尼龍線插入距分叉1.8 cm～2.0 cm并有輕微阻力,表明栓線穿過大腦中動脈起始端至近端,阻塞了大腦中動脈主干起始部。2 h后拔出線栓實現(xiàn)再灌。假手術(shù)組僅插入5 mm左右,余操作同前。

1.4 神經(jīng)行為學評分 待大鼠清醒后參考Longa等[6]方法進行行為障礙評分:無神經(jīng)功能缺失者0分;提尾時病灶對側(cè)前肢不能完全伸直者1分;爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈者2分;爬行時身體向?qū)?cè)傾倒者3分;不能自行行走,意識喪失者4分。

1.5 Western blot法檢測 p38MAPK、p-p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2及JNK蛋白的表達 BCA法測定腦組織提取物蛋白濃度。取適量標本經(jīng)凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上,隨后脫脂奶封閉,分別孵育一抗、二抗,最后進行化學發(fā)光,圖像經(jīng)Bio-Rad圖像采集系統(tǒng)分析處理。同時使用β-actin作內(nèi)參照。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。神經(jīng)行為學評分數(shù)據(jù)為等級變量,采用中位數(shù)/四分位數(shù)法表示,組間比較采用Kruskal-Wallis分析法,Mann-Whitney分析法進行兩兩比較。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)行為學評分 大鼠清醒后,SH組未見行為學異常表現(xiàn),評分均為0。I/R組均出現(xiàn)一定程度行為障礙,主要表現(xiàn)為提尾時左前肢不能充分伸展,爬行時向左側(cè)倒、轉(zhuǎn)圈,伴不同程度右側(cè)Horner's征。與SH組相比I/R組神經(jīng)行為學評分差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與 I/R組相比,Cur(20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg)組神經(jīng)行為學評分差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 姜黃素對大鼠神經(jīng)行為學評分的影響 分

2.2 ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達 ERK1/2表達各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。SH組可見p-ERK1/2表達,I/R組p-ERK1/2表達明顯下降(P＜0.05),Cur(20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg)組p-ERK1/2表達明顯上升(P＜0.05),其中尤以Cur(40 mg/kg)組最為顯著。詳見圖1、圖2。

圖1 姜黃素對ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達的影響

圖2 p-ERK1/2蛋白表達的相對灰度值

2.3 p38M APK、p-p38MAPK蛋白的表達 各組間p38M APK表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。SH組p-p38MAPK表達較少,I/R組p-p38MAPK表達明顯升高(P＜0.05)。Cur(20mg/kg、40mg/kg 、80mg/kg)組p-p38MAPK表達明顯下降(P＜0.05),其中尤以Cur 40 mg/kg組最為顯著。詳見圖 3、圖4。

圖3 姜黃素對p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達的影響

圖4 p-p38M APK蛋白表達的相對灰度值

2.4 JNK蛋白的表達 SH組JNK蛋白表達不明顯,I/R組JNK蛋白表達顯著升高(P＜0.05),不同濃度姜黃素組JNK蛋白表達明顯下降(P＜0.05),尤以Cur 40 mg/kg組為劇。詳見圖 5、圖 6。

3 討 論

ICVD臨床極為常見,并以高發(fā)病率、高致殘率、高病死率著稱。腦缺血再灌注損傷機制涉及興奮性氨基酸毒性、細胞信號轉(zhuǎn)導、線粒體損傷、氧自由基大量生成、免疫炎癥損傷、細胞凋亡學說等。缺血后神經(jīng)細胞死亡主要表現(xiàn)為壞死和凋亡,其中缺血中心區(qū)以壞死為主,為不可逆性損傷,而缺血周圍區(qū)以凋亡為主,及時恢復血供則是可逆的[7]。近年來,隨著對細胞信號轉(zhuǎn)導研究的日益加深,MAPKs超家族在調(diào)控細胞凋亡中的作用也日漸受到重視。M APKs超家族存在于所有真核生物中,為一族含絲氨酸/蘇氨酸殘基廣泛分布于細胞漿內(nèi)的蛋白激酶,是將細胞外刺激信號傳遞到細胞核,引起核反應(yīng)的重要信號傳導系統(tǒng),是細胞內(nèi)、外信號轉(zhuǎn)導的共同途徑或匯聚點[8,9]。現(xiàn)已明確的M APK信號轉(zhuǎn)導通路共有5條分別為JNK/應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)、p38MAPK、ERK3/4和 ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)信號轉(zhuǎn)導通路,目前研究較多的為前三條通路。研究表明MAPKs超家族與細胞凋亡關(guān)系密切,活化的MAPKs一方面可留于胞漿激活一系列蛋白激酶;同時可發(fā)生核轉(zhuǎn)位,通過調(diào)節(jié)目的基因如 c-Jun、c-fos、p53、c-myc、bax 等的表達調(diào)控細胞凋亡。各種刺激通過ERK生存通路促進細胞存活、抑制凋亡;JNK與P38MAPK通路則參與介導炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中的細胞凋亡。僅JNK和p38MAPK激活不足以引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡,只有JNK和p38MAPK通路持續(xù)激活同時伴ERK通路同步抑制才可誘導細胞凋亡。

姜黃素為姜黃屬植物中一種略帶酸性的黃色酚性物質(zhì),為姜黃屬植物發(fā)揮作用的最重要活性成分,中醫(yī)認為姜黃能行氣、散風活血、通經(jīng)止痛,臨床應(yīng)用廣泛。姜黃素以其清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、減輕鈣超載及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因等作用用于抗缺血再灌注損傷[10]。研究表明姜黃素對缺血組織JNK通路有一定抑制作用,亦可上調(diào)熱休克蛋白70(HSP70)、Bcl-2/Bax比值抗凋亡。亦有報道稱姜黃素預(yù)處理后對腦水腫有一定保護作用。本實驗結(jié)果顯示,姜黃素組神經(jīng)行為學評分明顯降低,表明姜黃素對腦缺血再灌注損傷有確切保護作用;Western blot法檢測結(jié)果表明,姜黃素組較I/R組p-p38MAPK及JNK蛋白表達明顯降低,而p-pERK1/2蛋白表達顯著上升,其中尤以姜黃素(20 mg/kg)組效果最為明顯,提示姜黃素抗腦缺血再灌注損傷作用可能與抑制p38MAPK和JNK/SAPK信號轉(zhuǎn)導通路,增強ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。

目前通過調(diào)節(jié)信號通路進行疾病治療日漸成為研究熱點,上調(diào)ERK1/2,同時下調(diào)p38MAPK和JNK/SAPK信號轉(zhuǎn)導通路可能成為腦缺血再灌注損傷治療新靶點。但對其下游作用基因,以及信號通路間相互作用仍需進一步深入研究,以為臨床ICVD治療提供新的理論依據(jù)。

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