薛 茜,鄒玉安,韓 敏,張 靜

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病重要的病理生理過(guò)程,防治腦缺血再灌注損傷一直是目前缺血性腦卒中治療的熱點(diǎn),中藥制劑對(duì)于腦缺血再灌注損傷后的保護(hù)作用受到眾多學(xué)者的重視。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠復(fù)制腦缺血再灌注損傷模型,以益氣活血化瘀、清熱平肝、熄風(fēng)定驚法立方制成的康腦液進(jìn)行干預(yù),觀察用藥前后對(duì)血清和腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)的含量變化,探討康腦液對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,為腦卒中的臨床預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 雄性標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)(清潔級(jí))Wistar大鼠30只(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重250 g～350 g)。隨機(jī)分成腦缺血再灌注模型組(模型組)、康腦液干預(yù)組及假手術(shù)組,每組各10只。

1.2 腦缺血再灌注損傷模型的復(fù)制 實(shí)驗(yàn)大鼠采用Bannister[1]建立的頸動(dòng)脈引流法。肌肉注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg全身麻醉,舌靜脈注射0.5%(1 mL/kg)肝素抗凝。分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及右側(cè)頸淺靜脈,用動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)頸總動(dòng)脈,同時(shí)結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈近心端及右側(cè)頸淺靜脈遠(yuǎn)心端,用自制的插管在右側(cè)頸總動(dòng)脈與右側(cè)頸淺靜脈間搭橋,使來(lái)自基底動(dòng)脈的血流經(jīng)Willis環(huán)由右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈逆向引流至頸靜脈造成腦缺血,90 min后開(kāi)夾并切斷右側(cè)頸總動(dòng)脈引流,使腦血流再灌注。假手術(shù)組除不行血管搭橋及頸總動(dòng)脈夾閉外,余手術(shù)過(guò)程相同。

1.3 中藥方劑組成、制備及給藥方法 組成:黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、三七粉等。制備:除三七粉外,常規(guī)煎煮兩次,再將兩煎的上清液混合,文火煎濃縮至70 mL,給藥前將三七粉溶于藥液中。給藥方法:每日灌胃給藥1次,連續(xù)15 d,每只鼠每次給藥2 mL(給藥量根據(jù)公式[2]計(jì)算,相當(dāng)于原生藥3.8 g)。給藥第15 d,給藥后2 h復(fù)制腦缺血再灌注模型。模型組及假手術(shù)組以等量生理鹽水代替中藥。

1.4 指標(biāo)測(cè)定 動(dòng)物缺血90 min再灌注180 min后頸總動(dòng)脈取血清5 mL置于離心管中,4℃冷藏備用。用預(yù)冷的生理鹽水制備10%腦組織勻漿,2 500 r/min離心10 min,取上清液-80℃保存?zhèn)錂z。以黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力;以硫代巴比妥酸法(TBA)測(cè)定MDA含量;以硝酸還原酶法測(cè)定NO活力;以雙縮脲法檢測(cè)腦組織蛋白含量。按試劑盒說(shuō)明嚴(yán)格操作。

1.5 試劑和儀器 SOD測(cè)定試劑盒(批號(hào) 20040812)、MDA測(cè)定試劑盒(批號(hào)20040828)及NO測(cè)定試劑盒(批號(hào)20040511)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。721型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,再用LSD法進(jìn)行兩兩比較,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 康腦液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠血清SOD、MDA、NO的影響(見(jiàn)表1)與假手術(shù)組相比,模型組血清中MDA、NO含量明顯增高,SOD含量明顯降低(P＜0.01);與模型組比較,康腦液干預(yù)組血清中MDA、NO含量明顯降低,SOD含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 康腦液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠血清SOD、MDA、NO的影響(±s)

表1 康腦液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠血清SOD、MDA、NO的影響(±s)

組別 n SOD U/mg MDA mmol/mg NO μ mol/mg假手術(shù)組 10 195.99±41.84 3.50±0.51 45.12±8.15模型組 10 125.66±20.791) 5.41±1.541) 83.67±13.671)康腦液干預(yù)組 10 182.81±17.622) 3.26±1.263) 55.14±10.603)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.2 康腦液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠腦組織勻漿SOD、MDA、NO的影響(見(jiàn)表2)與假手術(shù)組相比,模型組腦組織勻漿中MDA、NO含量明顯增高,SOD含量明顯降低(P＜0.01);與模型組相比,康腦液干預(yù)組腦組織勻漿中MDA、NO含量明顯降低,SOD含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 康腦液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠腦組織勻漿SOD、MDA、NO的影響(±s)

表2 康腦液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠腦組織勻漿SOD、MDA、NO的影響(±s)

組別 n SOD U/mg MDA mmol/mg NO μ mol/mg假手術(shù)組 10 38.84±0.85 1.75±0.40 9.30±1.76模型組 10 29.40±3.811) 3.26±0.851) 18.49±4.921)康腦液干預(yù)組 10 40.15±3.163) 2.12±0.643) 11.60±1.632)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

3 討 論

腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致嚴(yán)重的遲發(fā)神經(jīng)元損傷,影響患者的預(yù)后和功能恢復(fù),期間可發(fā)生復(fù)雜的繼發(fā)性改變,加重組織損傷。機(jī)體在正常情況下,氧自由基由于機(jī)體的代謝損傷而產(chǎn)生并依生理需要及時(shí)消除,在腦缺時(shí),自由基清除酶活性降低,自由基產(chǎn)生急劇增多,可廣泛的攻擊富含多不飽和脂肪酸的神經(jīng)細(xì)胞膜和血管,引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的瀑布效應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂,膜功能喪失,線粒體破壞,神經(jīng)元壞死。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)主要是在缺血后再灌注的早期[2],細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),磷脂被降解而變性失能。SOD是主要的抗氧化酶之一,它能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng),阻斷自由基的毒性反應(yīng)[3],清除超氧陰離子自由基,保護(hù)細(xì)胞免受損傷。氧自由基損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),生成大量脂質(zhì)過(guò)氧化物,最終產(chǎn)物是 MDA,MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物,間接反映了機(jī)體自由基產(chǎn)生的量和體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度,MDA的量?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。NO是體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)氣體信息分子,在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著信使分子的重要作用,參與多種生理功能調(diào)節(jié),腦內(nèi)NO在腦缺血再灌注損傷中的作用是雙重性的[4],一方面可以縮小梗死面積,增加皮質(zhì)供血;另一方面,可與缺血產(chǎn)生的氧自由基協(xié)同作用,造成神經(jīng)細(xì)胞損傷。缺血后數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)產(chǎn)生的NO具有毒性[4],主要機(jī)制有:通過(guò)氧自由基起細(xì)胞毒性作用;NO使各種含鐵-硫的酶失活,阻斷細(xì)胞內(nèi)能量合成及DNA的復(fù)制產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用;NO引起蛋白質(zhì)的ADP-核糖化,使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變,并導(dǎo)致迅速的能量耗竭,引起細(xì)胞死亡;NO引起多巴胺大量釋放而起神經(jīng)毒性作用。隨著缺血加劇及再灌注時(shí)間的延長(zhǎng),NO的含量明顯增多,加劇缺血再灌注損傷,可見(jiàn)NO水平與腦組織損傷程度相關(guān)[5,6]。

康腦液為自擬方,由黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、三七粉等組成,黃芪味甘性微溫,補(bǔ)氣升陽(yáng),益衛(wèi)固表,具有血管擴(kuò)張、改善血液循環(huán)、興奮中樞神經(jīng)作用;丹參味苦性微寒,活血祛瘀、消腫安神,具有擴(kuò)張血管、增強(qiáng)血流量的作用;川芎味辛性溫,活血行氣,具有擴(kuò)張血管、改善機(jī)體缺血缺氧狀態(tài)之功效;葛根味甘性辛涼,發(fā)表解肌、生津止渴,具有止痛、擴(kuò)張腦血管的作用;鉤藤味甘性微寒,熄風(fēng)定驚、清肝平肝,具有鎮(zhèn)靜、擴(kuò)張周?chē)?、調(diào)節(jié)血壓的功效;三七粉味甘性微苦,化瘀止血,消腫定痛,具有增加血流量、調(diào)整血壓降低耗氧量、抗血小板聚集之功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腦缺血90 min和再灌注180 min后,模型組大鼠血清和腦組織勻漿中MDA、NO含量顯著高于假手術(shù)組,SOD含量顯著低于假手術(shù)組;給予康腦液干預(yù)治療后,能顯著提高大鼠血清和腦組織勻漿中SOD的活性,降低MDA、NO的含量。表明康腦液方藥能較好的提高細(xì)胞抗氧化和抑制其脂質(zhì)過(guò)氧化作用,因而對(duì)缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

[1]Bannister CM,Sonia A.Ischemia and revascularzation of the middle cerebral territory of the rat brain by manipulation of the blood vessels in the neck[J].Surg Neurol,1984,21:351.

[2]Coert BA,Anderson RE,Meyer FB.A comparative study of the effects of two nitric oxide synthase inhibitors and two nitric oxide donors on temporary focal cerebral ischemia in the wistar rat[J].J Neurosurg,1999,90:332-338.

[3]張敬偉.NO,SOD與缺血性腦血管病的關(guān)系[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志,2005,5(5):900.

[4]De Alba J,Cardenas A,M oro MA,et al.Down-regulation of neuronal nitric oxide sy nthase by nitric oxide after oxygen-g lucose deprivation in rat forebrain slices[J].J Neurochem,1999,72(1):248-254.

[5]孟憲芳,施靜,劉曉春,等.大腦海馬腦片缺血-再灌注模型中一氧化氮及一氧化氮合酶的變化[J].中國(guó)腦血管病雜志,2004,1(10):457-460.

[6]Lerouet D,Beray-Berthat V,Palmier B,et al.Changes in oxidative stress,iNOS activity and neutrophil infiltration severe transient focal cerebral ischemia in rats[J].Brain Res,2002,958:166-175.