杜 艷,韓葆芬,胡曉蕓

纖溶系統(tǒng)的功能下降與血栓性疾病密切相關(guān),纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)是纖溶系統(tǒng)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子,高水平的PAI-1抑制纖溶系統(tǒng)的活性,參與血栓性疾病的發(fā)生發(fā)展過程。尼古丁作為香煙煙霧中的有害物質(zhì)之一,不僅可以活化炎性細(xì)胞,調(diào)控細(xì)胞凋亡,而且可以損傷血管內(nèi)皮,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,是血栓形成的重要危險(xiǎn)因素。本研究采用尼古丁干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),觀察尼古丁對(duì)PAI-1在蛋白及基因水平表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 HUVECs細(xì)胞株購自上海門諜塔生物科技發(fā)展有限公司。尼古丁購自美國Sigma公司;胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均為美國Gibco公司產(chǎn)品。PAI-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)公司;PCR引物由上海生工生物工程公司合成;T rizolRNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 HUVECs的培養(yǎng)與分組 HUVECs用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液,在 37℃、5%CO2箱中培養(yǎng),隔日換液 1次,待細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化液以1∶2傳代,接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞呈多角形或“鋪路石”樣排列,待 HUVECs達(dá)80%融合后隨機(jī)分為對(duì)照組與尼古丁組。對(duì)照組培養(yǎng)液中不加任何干預(yù);尼古丁組于培養(yǎng)液中加入一定體積的尼古丁,使其終濃度為100 μ mol/L。相同實(shí)驗(yàn)條件孵育12 h,收集各組細(xì)胞及上清液用于PAI-1mRNA及蛋白的檢測(cè)。

1.3 PAI-1蛋白的測(cè)定 采用ELISA法對(duì)各組細(xì)胞上清液進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按試劑盒說明步驟進(jìn)行。

1.4 RT-PCR檢測(cè)PAI-1 mRNA表達(dá) 按 Triol試劑盒說明提取細(xì)胞總 RNA。按轉(zhuǎn)錄試劑盒取6 μ L的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的cDNA。再取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μ L進(jìn)行 PCR的擴(kuò)增反應(yīng),PAI-1引物序列:上游5'-TGCCCTCTACTTCAACGG-3',下游5'-GTCGGTCATTCCCAGGTT-3',擴(kuò)增產(chǎn)物片斷 390bp。GAPDH 引 物 序列:上 游 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3',下游 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物片斷307bp。PCR循環(huán)條件:94℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共反應(yīng)32個(gè)循環(huán)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μ L,在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行吸光度(A)值的半定量分析。以PAI-1/GAPDH mRNA吸光度比值來表示PAI-1mRNA的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 經(jīng)SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HUVECs形態(tài)觀察 在倒置相差顯微鏡下觀察HUVECs,可見其形態(tài)不規(guī)則,呈扁平、橢圓形、梭形或多角形,為單層鵝卵石狀鑲嵌排列,細(xì)胞單層融合時(shí)呈典型的“鋪路石”樣外觀。

2.2 尼古丁對(duì)HUVECs PAI-1mRNA表達(dá)的影響 總RNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離可見28 s和18 s兩條清晰的條帶,表明RNA保持較好的分子完整性。PAI-1與GAPDH的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后,與Marker比較在100bp～500bp之間可見兩條分子量大小不同的特異性條帶,與預(yù)期長度相吻合,說明為特異性擴(kuò)增片段,GAPDH產(chǎn)物光密度值基本一致(見圖1)。尼古丁組 PAI-1mRNA(1.321±0.198)顯著增高,與對(duì)照組(0.729±0.100)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 尼古丁作用 HUVECs后PAI-1mRNA表達(dá)電泳圖

2.3 尼古丁對(duì)HUVECs PAI-1蛋白表達(dá)的影響 尼古丁組PAI-1蛋白表達(dá)與PAI-1 mRNA的變化一致,尼古丁組PAI-1蛋白為(21.084±0.829)ng/mL,對(duì)照組為(13.388±0.927)ng/mL,尼古丁組較對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)。

3 討 論

正常血管內(nèi)皮在維持凝血和纖溶系統(tǒng)功能上發(fā)揮重要作用,血管內(nèi)皮的受損,導(dǎo)致凝血功能亢進(jìn),纖溶系統(tǒng)失活,與多種血栓性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。大量的研究表明,吸煙是血栓性疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。香煙煙霧的主要有害成分尼古丁不但能引起炎性細(xì)胞的活化,調(diào)控細(xì)胞的凋亡,還能夠損傷血管內(nèi)皮,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,在血栓性疾病中起著關(guān)鍵作用。

PAI-1屬絲氨酸蛋白酶抑制物家族,是一種分子量約為50 kD的單鏈糖蛋白,是纖溶受損和血栓形成的標(biāo)志物[1]。其功能為滅活組織型纖溶酶原活化物(t-PA)和尿激酶型纖溶酶原活化物(u-PA),從而對(duì)機(jī)體的纖溶系統(tǒng)活性起到重要的調(diào)節(jié)作用。PAI-1在纖溶系統(tǒng)中起著決定性作用,其活性和水平的高低決定著纖溶系統(tǒng)活性的高低。本實(shí)驗(yàn)的前期研究表明,以不同濃度的尼古丁干預(yù)HUVECs后,各尼古丁組PAI-1含量均增高,但僅100 μ mol/L尼古丁組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;再以100μ mol/L尼古丁干預(yù)HUVECs,分別孵育0 h、4 h、6 h、8 h、12 h和 24 h后,可見隨著時(shí)間的延長,上清液的PAI-1含量逐漸增高,并于12 h達(dá)到高峰,提示尼古丁在一定范圍內(nèi)呈濃度和時(shí)間依賴性上調(diào)PAI-1的表達(dá),對(duì)血管內(nèi)皮的纖溶功能具有抑制作用,且引起變化的最佳尼古丁濃度是 100 μ mol/L,最佳作用時(shí)間是12 h。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)100 μ mol/L尼古丁作用于HUVECs12 h后的細(xì)胞PAI-1 mRNA進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,尼古丁不僅可以引起HUVECs上清液中PAI-1蛋白的高表達(dá),同時(shí)上調(diào)了PAI-1mRNA基因的轉(zhuǎn)錄水平,PAI-1蛋白和基因的表達(dá)一致,提示尼古丁在基因水平上誘導(dǎo)PAI-1的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控蛋白的分泌,高水平的PAI-1引起t-PA/PAI-1mRNA和蛋白比值的下調(diào)而抑制了纖溶系統(tǒng)的活性。而多種炎癥因子如脂多糖、白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子、凝血酶和纖維蛋白原也可促進(jìn)PAI-1的分泌[2,3]。作為對(duì)纖溶系統(tǒng)起決定作用的PAI-1,其在血漿中的水平及活性,既受許多環(huán)境因素的影響,又受機(jī)體遺傳基因決定,確切機(jī)制尚不清楚。近年來研究提示PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-675bp處,由于單個(gè)鳥嘌呤的插入或缺失形成了4個(gè)鳥嘌呤堿基序列(4G)或 5個(gè)鳥嘌呤堿基序列(5G)的多態(tài)性改變[4],可明顯影響PAI-1活性及水平[5]。

PAI-1基因4G/5G多態(tài)性與PAI-1的表達(dá)水平明顯相關(guān):4G/4G基因型的PAI-1血漿活性水平最高,4G/5G基因型居中,5G/5G基因型最低。Brown等[6,7]也認(rèn)為PAI-1(4G/4G)純合子的血漿PAI-1顯著升高,PAI-1基因型影響PAI-1的基礎(chǔ)濃度,也影響PAI-1受誘導(dǎo)后的濃度。

本研究結(jié)果表明尼古丁通過損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致PAI-1水平的升高,而PAI-1基因4G/5G的多態(tài)性與尼古丁誘發(fā)的PAI-1的高水平轉(zhuǎn)錄繼而導(dǎo)致血栓性疾病的發(fā)生是否呈正相關(guān),這有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。因此,深入研究PAI-1基因的多態(tài)性與血栓性疾病的關(guān)系,對(duì)進(jìn)一步闡明尼古丁所致血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制具有一定意義。

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