藥紅梅,呂吉元

在臨床工作中,如何減少、避免冠心病事件的發(fā)生是目前心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn),主要措施為去掉斑塊和穩(wěn)定斑塊[1]。許多大型臨床試驗(yàn)[2,3]表明他汀類藥物除了具有調(diào)脂、減少再狹窄外,還具有穩(wěn)定粥樣斑塊、抑制血栓形成、恢復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等作用。本研究旨在探討阿托伐他汀調(diào)脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 雄性Wistar大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室動(dòng)物室),阿托伐他汀(ATO,商品名立普妥,每片20 mg,德國(guó)Godecke GmbH公司生產(chǎn)),VD3注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司),膽固醇(成都科龍化工試劑廠),豬膽鹽(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司),丙基硫氧嘧啶(上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司),HEPES緩沖液,血脂系列檢測(cè)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司),丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所第一分所),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)放射免疫試劑盒(解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所),大鼠高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定試劑盒(美國(guó)BPB公司生產(chǎn),大連范邦試劑公司分裝),NF-κ B p65單克隆抗體(Santa Cruze公司),PV-9000二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、濃縮型DAB顯色試劑盒及其余免疫組化相關(guān)試劑(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組 24只健康雄性 Wistar大鼠,體重 180 g～220 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為兩組。對(duì)照組8只,飼喂正常飼料,動(dòng)脈粥樣硬化模型組16只,飼喂高膽固醇飼料,并在飼養(yǎng)開始時(shí),腹腔注射 VD 32 mL/kg(6×105 U/kg)。對(duì)照組則腹腔注射生理鹽水2 mL/kg。12周后模型建成。將建模成功的16只模型大鼠隨機(jī)分為模型組和藥物組,每組8只。藥物組大鼠給予10 mg/(kg?d)阿托伐他汀進(jìn)行灌胃治療,對(duì)照組和模型組以蒸餾水灌胃,治療共持續(xù)8周。

1.3 觀察指標(biāo)與方法 于治療前后分別測(cè)定大鼠血清血脂系列[總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI)]、MDA、SOD、IL-6、TNF-α、hs-CRP、ox-LDL含量的變化情況,以及治療后心肌 NF-κ B的激活情況。血脂、MDA、SOD采用化學(xué)法測(cè)定;IL-6、TNF-α采用放射免疫法測(cè)定;hs-CRP、ox-LDL采用ELISA法測(cè)定;NF-κ B采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用配對(duì)t檢驗(yàn)和方差分析,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組治療前后血脂比較(見表1)

表1 各組治療前后血脂比較(±s)

表1 各組治療前后血脂比較(±s)

組別 n TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)AI對(duì)照組 治療前 8 1.63±0.19 0.65±0.16 0.30±0.04 1.01±0.26 4.45±0.86治療后 8 1.80±0.45 0.32±0.211) 0.27±0.09 1.21±0.27 7.17±3.72模型組 治療前 8 13.91±4.65 0.71±0.43 0.38±0.09 13.22±5.17 33.54±12.70治療后 8 10.53±5.07 0.42±0.23 0.40±0.12 9.56±5.45 27.90±4.30藥物組 治療前 8 13.56±5.32 0.62±0.32 0.33±0.12 12.63±4.56 54.89±15.60治療后 8 9.09±2.772) 0.29±0.151) 0.30±0.22 8.68±3.041) 32.01±16.731)與同組治療前比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.2 各組治療前后各炎癥因子比較(見表2)

表2 各組治療前后炎癥因子比較(±s)

表2 各組治療前后炎癥因子比較(±s)

組別 n IL-6(pg/mL)TNF-α(ng/mL)hs-CRP(ng/dL)治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后對(duì)照組 8 47.18±17.61 49.02±18.50 1.36±0.20 1.59±0.37 51.27±20.60 53.83±26.39模型組 8 43.98±16.61 44.89±9.44 2.04±0.53 2.25±0.44 62.20±22.53 73.80±21.50藥物組 8 49.68±9.44 48.72±17.12 1.80±0.44 0.85±0.182) 56.67±23.23 49.56±28.501)與同組治療前比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.3 各組治療前后M DA、SOD和ox-LDL比較(見表 3)各組治療前后 MDA、SOD均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但藥物組有降低MDA,升高SOD的趨勢(shì)。藥物組治療后ox-LDL水平顯著低于治療前(P＜0.05)。

表3 各組治療前后MDA、SOD和ox-LDL的比較(±s)

表3 各組治療前后MDA、SOD和ox-LDL的比較(±s)

組別 n MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)ox-LDL(ng/dL)治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后對(duì)照組 8 4.39±1.82 3.75±1.56 140.85±4.82 139.76±3.84 35.67±12.13 46.30±5.91模型組 8 5.22±1.42 4.17±1.19 141.46±4.59 142.03±3.08 115.45±10.45 119.10±11.36藥物組 8 5.63±2.85 4.36±1.90 131.42±9.35 134.38±5.32 125.36±20.61 108.20±8.741)與同組治療前比較,1)P＜0.05

2.4 各組NF-κ B的免疫組化檢測(cè)結(jié)果 陰性對(duì)照是以PBS代替一抗所得的結(jié)果,可見核藍(lán)染,胞漿不著色。NF-κ B正常情況下處于失活狀態(tài),存在于胞漿中,所以對(duì)照組可見藍(lán)染的胞核,并有黃色顆粒物分布于胞漿。當(dāng)NF-κ B被激活時(shí),就會(huì)由胞漿進(jìn)入胞核,稱為核易位,在NF-κ B激活的陽(yáng)性細(xì)胞中可見,胞核在藍(lán)色的基礎(chǔ)上著有棕色,呈現(xiàn)出深棕色,胞漿中黃色顆粒物減少。在本實(shí)驗(yàn)中,每張切片隨機(jī)挑取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)核易位的細(xì)胞數(shù)目,計(jì)算平均核易位率。NF-κ B核易位率:藥物組為(9.37±4.28)%,對(duì)照組為(5.02±3.33)%,模型組為(15.40±10.09)%。藥物組與對(duì)照組 NF-κ B核易位率明顯低于模型組(P＜0.01)。

3 討 論

他汀類藥物是近十幾年開發(fā)的三羥基三甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,能有效地降低 LDL,提高HDL。經(jīng) 4S[4]、CARE[5]、LIPID[2]、WOS[6]、AFCAPS/TexCAPS[7]等大型臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其對(duì)冠心病的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防作用。許多年以來,人們將他汀類藥物的藥效單一歸結(jié)于它的調(diào)脂作用。近來有研究發(fā)現(xiàn)除了調(diào)脂作用外,他汀類藥物還有其他的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

3.1 調(diào)脂作用 他汀類藥物的調(diào)脂作用有助于AS斑塊的形成,而它對(duì)內(nèi)皮功能的改善、抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和聚集、誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的凋亡和抗炎等調(diào)脂外的作用不僅能減緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成,減小斑塊大小,還能穩(wěn)定斑塊,阻止AS斑塊的進(jìn)一步發(fā)展,對(duì)于臨床心血管事件的防治有重要意義。本研究結(jié)果顯示,藥物組明顯降低 AS大鼠的血清TC、TG、LDL含量,表明阿托伐他汀具有明顯的調(diào)節(jié)血脂作用。

3.2 抗炎作用 研究發(fā)現(xiàn),他汀類藥物在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中有潛在的抗炎和抗血栓作用,能抑制巨噬細(xì)胞因子的表達(dá)、NF-κ B的激活、對(duì)抗 ox-LDL誘導(dǎo)的一氧化氮合酶下調(diào)以及下調(diào)家族性高膽固醇血癥患者升高的血清可溶性CD40L(sCD40L)水平,對(duì)動(dòng)脈壁具有獨(dú)立于降膽固醇外的保護(hù)作用[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),藥物組治療后血中hs-CRP、TNF-α水平以及心肌組織中的NF-κ B水平均明顯低于模型組,說明阿托伐他汀具有抑制炎癥細(xì)胞在血管壁的積聚及減輕粥樣斑塊炎癥的作用,阿托伐他汀抑制炎癥的作用是其消退斑塊、穩(wěn)定斑塊及降低臨床心血管事件發(fā)生率的原因之一。

3.3 抗氧化作用 有研究表明,他汀類不但可以抑制LDL氧化,還可以減少巨噬細(xì)胞攝取LDL的能力[9]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)辛伐他汀、氟伐他汀可抑制ox-LDL的促鼠腹腔巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)作用。其他作者相繼證實(shí)他汀類藥物可抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子,減少ox-LDL的生成,抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)清道夫受體及組織因子,減少ox-LDL的攝取[10,11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ATO組治療后ox-LDL治療后較治療前顯著降低,即阿托伐他汀也同樣具有降低ox-LDL的作用,從而抑制ox-LDL在AS發(fā)生發(fā)展過程中的作用,增強(qiáng)了斑塊的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了血SOD活力和MDA含量。SOD活力反映了機(jī)體清除氧自由基的能力,MDA反映了機(jī)體受氧自由基損害的程度。結(jié)果表明阿托伐他汀治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但有提高機(jī)體SOD活力降低MDA含量的趨勢(shì)。阿托伐他汀具有獨(dú)立于調(diào)脂外的抗炎、抗氧化等多方面的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

[1]龍明智.冠狀動(dòng)脈內(nèi)斑塊形成和破裂的分子生物學(xué)研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2002,11(7):677-679.

[2]Jukema JW,Bruschke AV,van Boven AJ,et al.Effects of lipid lowering by pravastatin on progression and regression of coronary artery disease in symptomatic men with normal to moderately elevated serum cholesterol levels.The Reg ression Growth Evaluation Statin Study(REGRESS)[J].Circulation,1995,91(10):2528-2540.

[3]T he West of Scotland Coronary Prevention Study Group.A coronary primary prevention study of Scottish men aged 45-64 years:T rial design[J].J Clin Epidemiol,1992,45(8):849-860.

[4]Pedersen T R,Kjekshus J,Berg K,et al.Randomised trial of cholesterol lowering in 4 444 patients with coronary heart disease:The Scandinavian Simvastatin Survival Study(4S)[J].Atheroscler Suppl,2004,5(3):81-87.

[5]Sacks FM,Pfeffer MA,M oye LA,et al.T he effect of pravastatin on coronary events after my ocardial infarction in patients with average cholesterol levels.Cholesterol and Recurrent Events T rial investigators[J].N Engl J Med,1996,335(14):1001-1009.

[6]Shepherd J,Cobbe SM,Ford I,et al.Prevention of coronary heart disease with pravastatin in men with hypercholesterolemia[J].Atheroscler Suppl,2004,5(3):91-97.

[7]Downs JR,Clearfield M,Weis S,et al.Primary prevention of acute co ronary events with lovastatin in men and women with average cholesterol levels:Results of AFCAPS/TexCAPS.Air Force/Texas Coronary Atherosclerosis Prevention Study[J].JAMA,1998,279(20):1615-1622.

[8]Palinski W,T simikas S.Immunomodulatory effects of statins:Mechanisms and potential impact on arteriosclerosis[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(6):1673-1681.

[9]Bellosta S,Via D,Canavesi M,et al.HMG-CoA reductase inhibitors reduce MMP-9 secretion by macrophages[J].Arterioscler T hromb Vasc Biol,1998,18(11):1671-1678.

[10]Li D,Chen H,Romeo F,et al.Statins modulate oxidized lowdensity lipoprotein-mediated adhesion molecule expression in human coronary artery endothelial cells:Role of LOX-1[J].J Pharmacol Exp Ther,2002,302(2):601-605.

[11]Li DY,Chen HJ,Mehta JL.Statins inhibit oxidized-LDL-mediated LOX-1 expression,uptake of oxidized-LDL and reduction in PKB phospho rylation[J].Cardiovasc Res,2001,52(1):130-135.