蔣衛(wèi)民,顧 萍,王令諄,趙志英

作為多基因疾病[1],高血壓與胰島素抵抗(IR)密切相關(guān),因此胰島素抵抗途徑也就成為尋找高血壓相關(guān)基因突變的重要靶點,蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)作為胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負性調(diào)節(jié)因子,由于其編碼異常可以改變基因的表達和功能,PTP-1B基因成為引人注目的研究胰島素抵抗的靶基因之一[2]。前期已深入研究了高血壓患者胰島素抵抗中醫(yī)證候特點[3,4],本研究進一步探討胰島素抵抗證候特點與PTP-1B基因位點IVS6+G82A多態(tài)性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2006年1月—2007年6月南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科及南京軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科門診及住院治療的高血壓患者116例,其中男62例,年齡40歲～78歲(51.3歲±10.2歲);女54例,年齡49歲～76歲(55.6歲±9.8歲)。高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中國高血壓防治指南修訂委員會2005年制定的《中國高血壓防治指南》,所有入選患者均排除繼發(fā)性高血壓、糖尿病。以穩(wěn)態(tài)模式評估方法-HOMA-IR評估胰島素抵抗,將高血壓患者分為伴胰島素抵抗組(IR組)47例,不伴胰島素抵抗組(NIR組)69例,同時選取南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康體檢人群中腰圍女性小于80 cm,男性小于90 cm,且無糖尿病、高血壓、腫瘤、肥胖家族史的體檢者40名為正常組。

1.2 方法

1.2.1 胰島素抵抗評估 所有研究對象空腹12 h后,于6:00采靜脈血5 mL,以葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(FBG),以放免雙抗體法測定空腹胰島素(FINS),采用穩(wěn)態(tài)模式評估方法即HOMA-IR評估胰島素抵抗,以研究樣本背景人群HOMA-IR指數(shù)大于第75百分位點作為IR的分割點。

1.2.2 高血壓IR中醫(yī)證候特點評價 參照中華人民共和國衛(wèi)生部2002年制定的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則?高血壓辨證分型標(biāo)準(zhǔn)》進行肝火亢盛或陰虛陽亢型辨證,根據(jù)程度無、輕、中、重不同分別記為0分、1分、2分、3分,對以下陽亢主要證候要點進行積分評估:眩暈、頭痛頭脹、面紅目赤、口干口苦、煩躁、心悸失眠、便結(jié)溲黃、舌紅苔黃,脈弦細而數(shù)。

1.3 PTP-1B基因位點IVS6+G82A多態(tài)性檢測

1.3.1 外周靜脈血基因組DNA提取 用Dlass Milk-鹽酸胍/異硫氰酸胍方法抽提DNA(Sima公司)。

1.3.2 PTP-1B基因位點IVS6+G82A多態(tài)性分析 采取聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法(PCR)擴增,引物分別是F:AGGTCTGGAACCTTCTGTC,B:AACCGGGAGCCAGTTAAAC,反 應(yīng) 體 系 為 2 ×PCR MasterMix 25 μ L;ddH2O,23.5 μ L;引物 0.5 μ L;DNA 1 μ L;總體積 50 μ L。 反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個循環(huán);終末延伸 72℃ 5 min,PCR產(chǎn)物長度為244bp;反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳確認后,用限制性內(nèi)切酶HhaI在37℃條件下酶解PCR產(chǎn)物,2%瓊脂凝膠電泳分解酶切產(chǎn)物,紫外燈下觀察結(jié)果,PCR產(chǎn)物消化后應(yīng)產(chǎn)生三種基因型:AA型是244bp;AG型是244bp,127bp和117bp;GG型是127bp,117bp。

2 結(jié) 果

2.1 PTP-1B基因位點 IVS6+G82A基因型分布(見圖 1、圖2)116例高血壓患者及40名健康體檢者PTP-1B基因位點IVS6+G82A基因型分別為AA、AG和GG,等位基因為A和G。

圖2 IVS6+G82A多態(tài)性內(nèi)切酶HhaI基因分型

2.2 三組胰島素抵抗指標(biāo)及陽亢證候積分比較(見表1)IR組 、NIR組、正常組FBG比較無統(tǒng)計學(xué)意義;IR組FINS、HOM A-IR及陽亢證候積分均顯著高于NIR組和正常組;而NIR組和正常組比較,FINS、HOMA-IR無統(tǒng)計學(xué)意義,但陽亢證候積分顯著高于正常組。

表1 三組人群胰島素抵抗指標(biāo)及陽亢證候積分比較(±s)

表1 三組人群胰島素抵抗指標(biāo)及陽亢證候積分比較(±s)

組別 n FBG(mmol/L)FINS(mU/L)HOMA-IR 陽亢證候積分(分)正常組 40 4.65±1.86 6.35±1.62 2.18±0.95 3.26±1.53 IR組 47 5.42±2.01 9.95±2.201)2) 2.96±1.121)2) 22.73±6.241)2)NIR組 69 4.99±1.73 6.88±1.43 2.36±1.45 18.15±5.121)與正常對照組比較,1)P＜0.05;與NIR組比較,2)P＜0.05

2.3 高血壓患者PTP-1B基因位點IVS6+G82A含不同等位基因者IR指標(biāo)及陽亢證候積分比較(見表2)高血壓患者中不含A等位基因者(基因型GG)FBG與含A等位基因者(基因型 AG+AA)比較無統(tǒng)計學(xué)意義;但FINS、HOMA-IR及陽亢證候積分均顯著高于含A等位基因者。

表2 位點IVS6+G82A不同等位基因攜帶者胰島素抵抗指標(biāo)及陽亢證候積分比較(±s)

表2 位點IVS6+G82A不同等位基因攜帶者胰島素抵抗指標(biāo)及陽亢證候積分比較(±s)

組別 n FBG(mmol/L)FINS(mU/L)HOMA-IR 陽亢證候積分(分)含A等位基因 92 5.02±2.34 7.01±2.54 2.14±1.13 20.13±6.30不A等位基因 24 5.99±1.96 10.43±1.79 3.03±1.47 24.56±7.82 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.4 三組PTP-1B基因位點IVS6+G82A基因型分布頻率比較(見表3)GG型頻率IR組顯著高于正常組和NIR組,而NIR組和正常組比較無統(tǒng)計學(xué)意義;AA型頻率三組之間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義;AG型頻率IR組顯著低于NIR組,但與正常組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 三組PTP-1B基因位點IVS6+G82A基因型分布頻率比較 例(%)

3 討 論

IR是指胰島素敏感組織和細胞如肝臟、骨骼肌和脂肪細胞等對胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取和利用效能降低的一種病理生理狀態(tài),IR在高血壓中的重要作用已日益得到重視。IR和高胰島素血癥可以出現(xiàn)在許多遺傳和非遺傳的高血壓大鼠中,如自發(fā)性高血壓大鼠、Dahl鹽-敏感大鼠、Milan高血壓大鼠等[5-7]。IR發(fā)生機制非常復(fù)雜,但有證據(jù)顯示胰島素和胰島素受體結(jié)合后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常無疑是其主要機制。

PTP-1B是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一員,以跨膜受體樣蛋白和胞內(nèi)酶形式存在,催化蛋白質(zhì)酪氨酸去磷酸化反應(yīng),PTP-1B無特異性受體,與不同底物作用可調(diào)控不同的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,其在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面,一方面通過使胰島素受體去磷酸化,β亞單位的酪氨酸蛋白激酶(TK)活性受抑制,另一方面通過其底物去磷酸化而降低其與PI3K結(jié)合的能力從而阻止胰島素信號傳遞,實現(xiàn)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負性調(diào)節(jié)作用,這是胰島素抵抗發(fā)生中的潛在重要因素[8]。PTP-1B基因位于20q13.14/q13.2,為單拷貝基因,全長約74kb,共有10個外顯子,開放讀碼框包括1 305bp,編碼453個氨基酸的蛋白,研究發(fā)現(xiàn)其基因位于與糖尿病及肥胖相關(guān)同一染色體上[9,10]。目前研究已發(fā)現(xiàn)PTP-1B一些SNP與胰島素抵抗相關(guān)性疾病如糖尿病、肥胖、血脂異常相關(guān),Bento等[11]研究發(fā)現(xiàn)白種人的PTPN1多態(tài)性與2型糖尿病易感性顯著相關(guān),而非編碼區(qū)多態(tài)性作用更為重要。Santaniemi等[12]在芬蘭人(257例2型糖尿病患者,285例非糖尿病者)中發(fā)現(xiàn)位點IVS6+G82A突變與糖尿病患者的體重指數(shù)及尿微量白蛋白的含量密切相關(guān),同時發(fā)現(xiàn)它與糖尿病患者血壓可能有關(guān)。

胰島素抵抗是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個病理概念,其臨床無特異性表現(xiàn),古代中醫(yī)對此尚無認識,但因IR是代謝綜合征的病理生理基礎(chǔ),是高血壓、冠心病、糖尿病等多種疾病滋生的“共同土壤”,其臨床表現(xiàn)也多與這類病證相關(guān),因此多屬于中醫(yī)“消渴”“肥滿”“頭痛”“眩暈”“胸痹”等范疇。IR作為多種疾病所共有的病理生理基礎(chǔ),存在中醫(yī)病機證候的規(guī)律性和基本共性,我們前期研究已證實高血壓胰島素抵抗病機特點之一是在肝腎陰虛基礎(chǔ)上所表現(xiàn)出的肝陽(火)亢盛[3,4],本研究進一步探討了這一基本證候特點的遺傳學(xué)基礎(chǔ),結(jié)果表明高血壓胰島素抵抗患者陽亢證候積分顯著高于正常體檢者及非胰島素抵抗高血壓患者,表現(xiàn)為肝陽亢盛的證候特點,而胰島素抵抗患者的PTP-1B基因IVS6+G 82A位點GG基因型頻率也明顯高于正常體檢者及非胰島素抵抗者,不含 A等位基因者FINS、HOMA-IR及陽亢證候積分顯著高于含A等位基因者(AA型+AG型),從而證實PTP-1B基因IVS6+G82A位點G突變與高血壓IR肝陽亢盛證候特點具有一定的相關(guān)性。由于IR與糖尿病、冠心病、肥胖等均有相關(guān),在高血壓人群中發(fā)現(xiàn)的這一特點如果能證實在其他胰島素抵抗相關(guān)性疾病中同樣存在,將為以清肝瀉火為原則治療此類疾病的中醫(yī)“異病同治”理論尋找到了部分遺傳學(xué)證據(jù)。

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