洪 梅 刁其玉 閆貴龍 屠 焰 張乃鋒 姜成鋼

青貯飼料是反芻動(dòng)物飼料的重要組成部分，青貯菌制劑通過(guò)微生物作用，可以改善青貯產(chǎn)品品質(zhì)，有效延長(zhǎng)青貯飼料的保存時(shí)間，具有重要的使用價(jià)值。青貯的原理是在厭氧條件下，通過(guò)附著于植物體的乳酸菌利用原料中的可溶性碳水化合物，發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸（主要是乳酸），迅速降低pH值，從而殺滅或者抑制各種微生物的活動(dòng)，達(dá)到長(zhǎng)期保存青綠飼料的目的。同型發(fā)酵乳酸菌是非常重要的青貯飼料菌制劑，例如植物乳桿菌和片球菌等，它們能夠迅速降低pH值，提高乳乙酸的生成比例，有效降低乙醇和氨態(tài)氮的產(chǎn)量。以往的試驗(yàn)大多集中在研究同型發(fā)酵乳酸菌上，而且在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用也較廣泛，它們對(duì)于飼料的保存，提高飼料適口性以及提高奶牛的生產(chǎn)性能具有顯著作用。相比之下，關(guān)于異型發(fā)酵乳酸菌的研究較少，而且目前大多集中研究布氏乳桿菌對(duì)青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響，對(duì)其他異型發(fā)酵乳酸菌的研究則更少，但事實(shí)上除此之外，還有很多優(yōu)良的菌株有待開(kāi)發(fā)推廣。例如乳桿菌科乳桿菌屬的發(fā)酵乳桿菌，屬于異型發(fā)酵乳酸菌類(lèi)，其廣泛分布于人和動(dòng)物的胃腸道中，能在人體胃液低pH值和腸道高膽汁酸環(huán)境中存活，對(duì)胃酸、膽汁和胰腺分泌物具有很強(qiáng)的耐受性，而且發(fā)酵碳水化合物的能力較強(qiáng)，在食品發(fā)酵和醫(yī)療保健領(lǐng)域應(yīng)用較多。研究證明，發(fā)酵乳桿菌是腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群，通過(guò)對(duì)致病菌的拮抗作用、抗氧化作用、免疫調(diào)節(jié)作用以及對(duì)α-低聚半乳糖的降解作用等對(duì)腸道局部免疫產(chǎn)生重要影響。另外，發(fā)酵乳桿菌還具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)糖基活性，不僅可以降低乳糖含量，緩解乳糖不耐癥，而且可以生成低聚半乳糖，進(jìn)一步提高發(fā)酵乳的品質(zhì)。但是，目前關(guān)于發(fā)酵乳桿菌對(duì)于青貯飼料的研究卻很少，本試驗(yàn)從中國(guó)青貯窖中分離到一株發(fā)酵乳桿菌，并且在不同條件下對(duì)其進(jìn)行人工培養(yǎng)，測(cè)知其生物學(xué)特性，以探索其在人工環(huán)境下的最佳生長(zhǎng)條件，為規(guī)?；a(chǎn)新型青貯菌制劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用菌

供試菌株是本實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)青貯窖中分離、篩選的，編號(hào)為BLF01,由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 乳酸菌的總DNA提取及16S rDNA基因擴(kuò)增

16S rDNA由于其高度保守型廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的細(xì)菌序列被測(cè)定并收錄在Gen Bank,為菌種的鑒定提供了快捷、方便的平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)青貯窖中分離、篩選的1株細(xì)菌，使用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取菌株DNA，引物為原核生物16S rDNA的通用引物，27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和 R 1492:5'-TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。擴(kuò)增條件為95℃5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃2 min,30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。16S r DNA PCR產(chǎn)物全序列由北京博邁德生物有限公司測(cè)定。測(cè)得序列與Blast比對(duì)，該菌株與Gen Bank中的Lactobacillus fermentum strain 44197（登錄號(hào)：DQ779203.1）相似度為99%。

1.1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分

MRS培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、檸檬酸二胺2 g、乙酸鈉5 g、硫酸鎂 0.1 g、硫酸錳 0.05 g、磷酸氫二鉀 2 g、吐溫 801 ml、瓊脂 15 g、去離子水 1000 ml，1×105Pa 滅菌 30 min。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，篩選菌株生長(zhǎng)的最適碳源、氮源、接種量、培養(yǎng)基起始pH值及其培養(yǎng)溫度。

1.2.2 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

將種子液接種后，每隔3 h取樣測(cè)定發(fā)酵液的pH值及OD600nm值，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以pH值和OD值為縱坐標(biāo)繪制菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.3 不同碳源對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

以MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，分別以等量百分比的果糖、蔗糖、乳糖替代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖(20 g/1000 ml)，在37℃條件下培養(yǎng)24 h,測(cè)定活菌數(shù)，確定菌株生長(zhǎng)的最適碳源。

1.2.4 不同氮源對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

方法與1.2.3相同，以MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，分別以等量百分比的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉以及牛肉膏替代MRS中的氮源（即大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏，總計(jì)25 g/1000 ml），在37℃條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定活菌數(shù)，確定菌株生長(zhǎng)的最適氮源。

1.2.5 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

采用單因素試驗(yàn)方法，用1 mol/l的鹽酸和1 mol/l的氫氧化鈉將MRS培養(yǎng)基的起始pH值分別調(diào)至2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0，培養(yǎng)過(guò)程中不調(diào)酸，在600 nm條件下測(cè)定菌液的OD值,確定最佳起始pH值。

1.2.6 培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，采用單因素試驗(yàn)方法，將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為30、35、37、40、42 ℃，按照 1%（v/v）的接種量接入種子液，靜置培養(yǎng)24 h，在600 nm條件下測(cè)定菌液OD值，確定菌株生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)溫度。

1.2.7 接種量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，采用單因素試驗(yàn)方法，將接種量分別設(shè)定為 0.5%、1%、2%、4%、6%、8%，37℃靜置培養(yǎng)24 h。測(cè)定活菌數(shù)，確定最適接種量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS8.0軟件包中的one-way ANOVA過(guò)程對(duì)單因素試驗(yàn)分析的結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，均值的多重比較采用Duncan's法進(jìn)行，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)；以Box-Behnken進(jìn)程對(duì)響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行二次響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 BLF01在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

圖1 BLF01的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

圖2 BLF01在MRS培養(yǎng)基中pH值的變化

將BLF01接種于MRS液體培養(yǎng)基中，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 h取樣，測(cè)其OD值和pH值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值及pH值為縱坐標(biāo)，繪制其生長(zhǎng)曲線(xiàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖1、圖2所示。

從圖1可以看出，菌株在經(jīng)過(guò)培養(yǎng)3 h左右已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在培養(yǎng)6 h時(shí)，生長(zhǎng)速率降低，但是仍然緩慢生長(zhǎng)，培養(yǎng)12 h后開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，15 h到達(dá)穩(wěn)定后期，這與圖2顯示的隨著菌株的生長(zhǎng)，菌液的pH值變化趨勢(shì)相符合。當(dāng)BLF01培養(yǎng)0～3 h時(shí)，菌液的pH值迅速下降，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)較快，發(fā)酵產(chǎn)生的酸較多；培養(yǎng)到15 h時(shí)，pH值趨于穩(wěn)定，說(shuō)明此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的大量乳酸已經(jīng)開(kāi)始抑制BLF01的生長(zhǎng)，因此把BLF01在MRS培養(yǎng)基中的穩(wěn)定后期，即15 h作為最佳收獲期。

2.2 不同碳源對(duì)BLF01生長(zhǎng)的影響（見(jiàn)表1）

表1 不同碳源對(duì)BLF01生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，以乳糖為碳源時(shí)培養(yǎng)BLF01所得活菌數(shù)顯著高于其他組（P＜0.05），蔗糖、葡萄糖與乳糖對(duì)活菌數(shù)的影響差異不顯著，所以選擇乳糖作為最適碳源。

2.3 不同氮源對(duì)BLF01生長(zhǎng)的影響（見(jiàn)表2）

表2 不同氮源對(duì)BLF01生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，以酵母粉作為氮源培養(yǎng)BLF01時(shí)所得活菌數(shù)與MRS培養(yǎng)基的活菌數(shù)差異不顯著，但是顯著高于以大豆蛋白胨或胰蛋白胨作為氮源時(shí)所得的活菌數(shù)。另外，當(dāng)以牛肉膏為單一氮源時(shí)，BLF01幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，說(shuō)明單一使用牛肉膏不利于BLF01的生長(zhǎng)?？紤]到酵母粉價(jià)格更加低廉，培養(yǎng)基配制更加容易操作，本試驗(yàn)將酵母粉作為BLF01的最佳氮源。

2.4 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)BLF01生長(zhǎng)的影響

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的起始pH值按照要求調(diào)整為2.0～8.0，培養(yǎng)24 h后，測(cè)定不同起始pH值培養(yǎng)基的OD600nm值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 起始pH值對(duì)BLF01生長(zhǎng)的影響

由圖3可以看出，BLF01最適生長(zhǎng)的起始pH值范圍為3.0～8.0，說(shuō)明此菌的適應(yīng)性較強(qiáng)。起始pH值為6.5、7.0、8.0時(shí)，培養(yǎng)BLF01所得的活菌數(shù)與其他組相比差異顯著（P＜0.05），但是起始pH值為8.0時(shí)，OD值最高，表明此時(shí)生物量最高，所以選擇最適起始pH值為8.0。另外需要注意的是，當(dāng)培養(yǎng)基的起始pH值為2.0時(shí)，OD值為0，表明此時(shí)菌株幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，說(shuō)明pH值過(guò)低會(huì)威脅BLF01的存活。

2.5 溫度對(duì)BLF01生長(zhǎng)的影響

不同的乳酸菌最適生長(zhǎng)的溫度范圍有一定的差異。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將BLF01接種于固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于不同溫度下靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)定活菌數(shù)。結(jié)果如表3所示。

表3 溫度對(duì)BLF01生長(zhǎng)的影響

從表3中可以看出，培養(yǎng)溫度為35、40、42℃時(shí)，BLF01的菌落數(shù)差異不顯著，所得活菌數(shù)顯著高于其他組（P＜0.05），但是溫度為40℃時(shí)，菌落數(shù)平均值低于溫度為35℃和42℃時(shí)的菌落數(shù)，另外從節(jié)約能源的角度出發(fā)，我們選擇35℃為BLF01的最適培養(yǎng)溫度。

2.6 接種量對(duì)BLF01生長(zhǎng)的影響

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將培養(yǎng)的種子分別以不同的百分比接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，測(cè)定活菌數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 接種量對(duì)BLF01生長(zhǎng)的影響

由表4結(jié)果可知，在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，接種量不會(huì)顯著影響菌株的生長(zhǎng)（P=0.1127）。培養(yǎng)BLF0124 h后，接種量分別為0.5%、1%、2%、6%和8%時(shí)，所得的活菌數(shù)之間差異不顯著；當(dāng)接種量為1%、2%、4%、6%和8%時(shí)，所得的活菌數(shù)之間差異不顯著。所以我們選擇最適宜接種量為1%。

2.7 討論

有研究表明，與其他乳酸菌相比，發(fā)酵乳桿菌耐酸性更強(qiáng)，在青貯飼料發(fā)酵前期發(fā)酵效果更加理想，更能有效地防止蛋白質(zhì)降解和干物質(zhì)損失。而本試驗(yàn)中發(fā)酵乳桿菌BLF01在pH值為3～8，溫度為30～42℃的范圍條件下都能生長(zhǎng)，說(shuō)明其生長(zhǎng)適應(yīng)性很強(qiáng)。在中國(guó)用于制作青貯飼料的常用原料如玉米、苜蓿等，收割時(shí)原料的pH值范圍為4.6～6.3，正適合BLF01的生長(zhǎng)繁殖，為其成為主導(dǎo)菌群提供了有利條件。此外，青貯飼料的制作時(shí)間通常為夏季，環(huán)境溫度在30℃以上，非常適合BLF01的生長(zhǎng)，所以可以考慮將發(fā)酵乳桿菌BLF01作為一種青貯添加劑使用。

3 結(jié)論

①適合BLF01生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，最佳碳源是乳糖、最佳氮源是酵母粉；

②BLF01的最佳培養(yǎng)條件是起始pH值8.0，溫度35℃，接種量1%。

18篇，刊略，需者可函索）