王 穎 馬海樂(lè)

隨著啤酒工業(yè)迅速發(fā)展，啤酒糟作為啤酒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物其產(chǎn)生量也在增加。啤酒糟中固形物含量一般為15%～25%，水分含量高，極易腐敗變質(zhì)，但干糟中含粗蛋白35%～51%，加以開(kāi)發(fā)也是一種很好的飼料蛋白來(lái)源。目前國(guó)內(nèi)多數(shù)啤酒生產(chǎn)企業(yè)將啤酒糟直接出售用作飼料，這種飼料中的非蛋白氮和無(wú)機(jī)氮不能被飼養(yǎng)動(dòng)物有效利用，纖維素也阻礙了營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，由于含水量較高，很難貯藏，一旦滯銷(xiāo)很容易霉?fàn)€、腐敗而影響環(huán)境。利用固態(tài)發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化啤酒糟可以將其成分改性，很多研究表明利用發(fā)酵方法可以有效提高啤酒糟蛋白質(zhì)含量。

在混菌發(fā)酵啤酒糟的過(guò)程中，微生物和發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)發(fā)生著復(fù)雜的物理、化學(xué)和生物以及物質(zhì)和能量的傳遞。在周?chē)鷱?fù)雜的外界條件中，影響啤酒糟固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白飼料的因素較多。本研究以啤酒糟為主要原料，以培養(yǎng)一段時(shí)間的枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母菌的豆粕培養(yǎng)液為菌種，以接種量、發(fā)酵時(shí)間、尿素添加量以及硫酸銨添加量等為因素建立正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)選，生產(chǎn)出蛋白氮含量高的活性飼料。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：啤酒濕糟，鎮(zhèn)江天目湖啤酒有限公司提供，干糟中真蛋白含量約為21%；豆粕，用錘片式粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，丹陽(yáng)市正大油脂有限公司提供。

菌種：枯草芽孢桿菌M5094、熱帶假絲酵母C3161，由常州新區(qū)三環(huán)生物工程成套設(shè)備有限公司提供。

主要培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基(培養(yǎng)酵母用)和LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)枯草芽孢桿菌用)；液體種子培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基 (培養(yǎng)酵母用)和LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)枯草芽孢桿菌用)。

1.2 發(fā)酵處理方法

混菌豆粕培養(yǎng)液制備：挑取枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母菌各一環(huán)接入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)1 d后接入滅菌的豆粕培養(yǎng)液中，豆粕培養(yǎng)液成分為豆粕15 g，葡萄糖添加量1 g，自來(lái)水85 ml，pH值4.5。

啤酒糟發(fā)酵：將生長(zhǎng)3 d的混菌豆粕培養(yǎng)液接入啤酒糟培養(yǎng)基。考察基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分、接種量、硫酸銨添加量和尿素添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品真蛋白的影響。

1.3 發(fā)酵產(chǎn)品真蛋白測(cè)定方法

發(fā)酵產(chǎn)物在60℃下烘干后粉碎，準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣1～2 g置于250 ml燒杯中，加蒸餾水50 ml煮沸30 min。依次加入10%硫酸銅水溶液20 ml和2.5%氫氧化鈉溶液20 ml，邊加邊攪拌，加完后繼續(xù)攪拌幾分鐘。放置2 h或靜置過(guò)夜，沉淀物以中速定量濾紙過(guò)濾。用70℃以上熱水反復(fù)洗滌沉淀，直至濾液無(wú)沉淀為止(取氯化鋇試液滴于表面皿中，加2 mol/l鹽酸溶液1滴，滴入濾液，在黑色背景下觀察應(yīng)無(wú)白色沉淀)。然后，將濾紙和沉淀物包好，放人烘箱中在65～70℃下干燥2 h。

將濾紙與沉淀物一起放入凱式燒瓶中，消化后用凱式定氮法測(cè)定樣品中真蛋白含量，同時(shí)做空白對(duì)照(對(duì)應(yīng)加入一塊濾紙消化)。

2 結(jié)果與討論

2.1 啤酒糟與豆粕配比的選擇

試驗(yàn)用啤酒糟含水量為75%，含水量較多，而豆粕粉含水量為9%，在啤酒糟中添加適宜的豆粕粉，可以吸收濕糟多余的水分，同時(shí)提高發(fā)酵物營(yíng)養(yǎng)成分。試驗(yàn)選擇啤酒糟與豆粕粉配比分別為：9：1、8：2、7： 3、6： 4。其中 9： 1、8： 2 配比時(shí)豆粕不能完全吸收酒糟的水分，混合物底層有滲下來(lái)的水分；而6：4配比時(shí)豆粕添加量稍多，混合物底層有未吸附水分的豆粕；7：3配比最適，豆粕粉可與啤酒糟均勻混合。本試驗(yàn)選擇啤酒糟與豆粕配比為7：3。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響（見(jiàn)圖1）

試驗(yàn)設(shè)置為：基質(zhì)培養(yǎng)基成分為啤酒糟70%、豆粕粉 30%；發(fā)酵時(shí)間選擇 1、2、3、4、5、6 d；接種量20%；50 g基質(zhì)培養(yǎng)基放入250 ml的藍(lán)蓋瓶?jī)?nèi)，置于28℃培養(yǎng)。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)真蛋白含量的影響

由圖1可見(jiàn)，在發(fā)酵初期，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)品中真蛋白含量先增加，之后逐步降低，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為2 d時(shí)，產(chǎn)品中真蛋白含量最高。故此時(shí)應(yīng)停止發(fā)酵，如繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白含量會(huì)因微生物的自溶而下降。在工業(yè)化生產(chǎn)中，發(fā)酵周期過(guò)長(zhǎng)，還可能造成雜菌污染，影響發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，增加生產(chǎn)成本，故發(fā)酵時(shí)間以2 d左右為宜。

2.3 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響（見(jiàn)圖2）

試驗(yàn)設(shè)置為：發(fā)酵時(shí)間為2 d；接種量選擇10%、20%、30%、40%、50%；基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同上。

圖2 接種量對(duì)產(chǎn)品真蛋白含量的影響

由圖2可見(jiàn)，隨著接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量先增高再下降，當(dāng)接種量為20%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量最高，當(dāng)繼續(xù)增加接種量時(shí)，真蛋白含量反而下降，這主要是由于接種量過(guò)大，雖使發(fā)酵周期縮短，菌體生長(zhǎng)速度加快，但菌絲易老化，且發(fā)酵中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更多的消耗在菌體生長(zhǎng)上，故產(chǎn)品中真蛋白的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.4 硫酸銨添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響（見(jiàn)圖3）

試驗(yàn)設(shè)置為：接種量20%；硫酸銨添加量選擇0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；發(fā)酵時(shí)間、基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同上。由圖3可以看出，添加硫酸銨混菌發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)含量明顯提高，但當(dāng)添加量達(dá)到0.5%以后，繼續(xù)添加硫酸銨，產(chǎn)物真蛋白質(zhì)含量不再增加。所以選擇0.5%為最佳硫酸銨添加量。

圖3 不同濃度的硫酸銨對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量的影響

2.5 尿素添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響（見(jiàn)圖4）

試驗(yàn)設(shè)置為：硫酸銨添加量為0.5%；尿素添加量選擇 0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；接種量、發(fā)酵時(shí)間、基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同上。

圖4 不同濃度的尿素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4可以看出，尿素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量的作用規(guī)律與硫酸銨相似。添加尿素混菌發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白含量明顯提高，隨著尿素添加量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量相應(yīng)增高，但當(dāng)添加量增加到1%以后，繼續(xù)添加尿素，產(chǎn)物真蛋白含量不再增加。而且，氮源添加量濃度過(guò)高，產(chǎn)品有較刺鼻的氨味，產(chǎn)品風(fēng)味變差。

由圖3和圖4可見(jiàn)，混菌固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中對(duì)于超過(guò)1.0%高濃度的非蛋白氮源利用率較小，而且在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)硫酸銨和尿素的利用能力都較好，此結(jié)果與張福元研究結(jié)論一致。

2.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵時(shí)間、接種量、硫酸銨添加量和尿素添加量為試驗(yàn)因子，進(jìn)行四因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)。以酒糟發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)品真蛋白含量為考察指標(biāo)。試驗(yàn)安排、試驗(yàn)結(jié)果及試驗(yàn)分析如表1、2、3 所示。

表1 正交試驗(yàn)L9(34)影響因素及水平

由表2可知，極差分析所得最優(yōu)展望組合為A1B2C1D2，按照極差大小，影響啤酒糟發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)品真蛋白含量的4個(gè)因素的主次順序依次為A>B>D>C，即培養(yǎng)天數(shù)、接種量、硫酸銨添加量、尿素添加量。經(jīng)方差分析(見(jiàn)表3)可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)啤酒糟發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)品真蛋白含量有顯著性影響。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)直觀分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

因最優(yōu)展望組合A1B2C1D2未在正交表中，所以對(duì)該展望組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。采用3個(gè)批次，每批3個(gè)平行樣，測(cè)量結(jié)果真蛋白平均值為39.13%，高于正交表中的最大值38.49%，由此，確定組合A1B2C1D2為本試驗(yàn)最優(yōu)反應(yīng)條件，即最佳發(fā)酵條件為啤酒糟與豆粕粉混合比例為7：3，硫酸銨添加量為0.5%，尿素添加量為0.5%，混菌豆粕培養(yǎng)液接入量為20%，發(fā)酵時(shí)間為1 d。

3 結(jié)論

(1)通過(guò)啤酒糟和豆粕粉的合理配比，可以利用豆粕吸附酒糟中過(guò)多的水分，達(dá)到適宜的固態(tài)發(fā)酵含水量，可節(jié)省工業(yè)步驟，簡(jiǎn)化操作過(guò)程。

(2)混菌發(fā)酵啤酒糟可明顯提高啤酒糟中的蛋白含量，提高啤酒糟的營(yíng)養(yǎng)。真蛋白可提高到39.13%。

(3)發(fā)酵天數(shù)是發(fā)酵的主要因素，經(jīng)過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)，測(cè)得最優(yōu)工藝條件為：啤酒糟與豆粕粉混合比例為7：3，硫酸銨添加量為0.5%，尿素添加量為0.5%，混菌豆粕培養(yǎng)液接入量為20%，發(fā)酵時(shí)間為1 d。

若干篇，刊略，需者可函索）