黃春剛 郭金栓 高麗霞

缺血再灌注腦(I/R)損傷發(fā)生機制十分復雜，很多機制尚未能明了?，F(xiàn)已認識到腦I/R可激活一系列分子反應，從而導致腦組織的損傷。環(huán)氧化酶-2(COX-2)在I/R腦損傷組織中表達增強，但COX-2在I/R中作用即COX-2與神經(jīng)元凋亡的關系研究不多。本研究通過大鼠I/R模型，分析腦組織COX-2的表達，探討COX-2在I/R中的作用，尋找臨床治療I/R的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑:COX-2特異性抑制劑 NS398(Sigma-Aldrich，USA);細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德公司);兔抗人COX-2單克隆抗體(福州邁新生物技術有限公司);DAB顯色試劑盒(福州邁新生物公司)。

1.2 動物分組及模型的制備 實驗動物為健康雄性SD大鼠，8～12周齡，體重250～300 g，購自河南省實驗動物中心。隨機分為對照組12只、假手術組12只、I/R組84只、I/R+NS39824 h組12只，其中I/R組分為腦缺血1 h再灌注15min、2 h、6 h、24 h、2 d、4 d、16 d。I/R 組:參照 Zea-Longa 等的頸外動物線栓法建立MCAO動物模型［1］。I/R+NS398組:術前30min腹腔注射NS398(5mg/kg，溶于5mg/ml DMSO);假手術組:假手術組線栓僅插入1cm;對照組:注射與抑制劑組等體積的DMSO。I/R模型制作完成后觀察大鼠行為，采用Longa的5級神經(jīng)缺陷評分法對大鼠進行神經(jīng)功能評分，以判斷模型是否成功。

1.3 標本采集 麻醉后的大鼠仰臥位固定，開胸，暴露心臟，行左心室穿刺入升主動脈，剪開右心耳，肝素0.9%氯化鈉溶液經(jīng)左升主動脈沖洗內(nèi)臟血液，4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液經(jīng)心灌流固定，待大鼠全身僵硬后，斷頭取出腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h。固定腦組織標本，修塊后進行常規(guī)脫水，石蠟包埋，標本取材范圍為額極6mm處，行冠狀面連續(xù)切片，切片厚度為5 μm。

1.4 TUNEL法 石蠟切片脫蠟。0.01 mol/L PBS沖洗后滴加蛋白酶 K胃蛋白酶復合消化液 1滴，4℃消化 30min。0.01 mol/L PBS沖洗后滴加 TUNEL標記反應混合液20 μl，37℃孵育1 h。0.01 mol/L PBS 沖洗后滴加 POD 20 μl，37℃孵育30min。0.01 mol/L PBS沖洗后滴加 DAB 顯色劑 50 μl，顯色。經(jīng)脫水，透明，封片。

1.5 免疫組化SP法 常規(guī)脫蠟，用TBST洗3次;水浴法熱修復;3%過氧化氫阻斷內(nèi)源過氧化物酶，TBST洗3次;用血清室溫孵育10min;組織切片加入兔抗人COX-2單克隆抗體(1∶150)，4℃過夜;TBST洗3次后，加入生物素標記第二抗體室溫孵育20min;TBST洗3次，加入鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶室溫孵育20min，DAB顯色，封片，應用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定OD值。

1.6 蛋白免疫印跡法 大鼠麻醉后取腦，分離缺血再灌注組區(qū)的海馬，置入細胞裂解液中，低溫勻漿，取上清，－80℃保存?zhèn)溆?。蛋白定量后，?0μg樣品在聚丙烯酰胺凝膠上電泳完，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，取相應條帶加入COX-2單抗，4℃過夜，與生物素標記的羊抗兔/小鼠IgG抗血清孵育2 h，TBST洗滌后，與卵白素-辣根過氧化物酶復合物孵育0.5 h，DAB顯色。將特異性蛋白條帶掃描，應用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定平均灰度值。

1.7 統(tǒng)計學分析 應用 SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用單因素方差分析和Person方法相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MCAO動物模型復制成功 實驗栓線鼠即刻出現(xiàn)右側(cè)Horner綜合癥(右側(cè)瞳孔縮小)，麻醉清醒時出現(xiàn)左側(cè)前肢或前后肢癱瘓，如規(guī)定缺血時限內(nèi)未出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓或已死亡的動物被剔除。

2.2 TUNEL形態(tài)觀察及計數(shù)結果 對照組、假手術組、I/R 15min偶見有TUNEL陽性細胞。I/R 2 h海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞開始增加，并于24 h達高峰;I/R+NS39824 h組TUNEL陽性細胞數(shù)明顯減少，與I/R 24 h比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表1、2，圖1～3。

表1 大鼠I/R損傷后不同時間海驅(qū)TUNEL凋亡數(shù)比較 n=12，

表1 大鼠I/R損傷后不同時間海驅(qū)TUNEL凋亡數(shù)比較 n=12，

注:與假手術組比較，*P ＜0.05

組別 TUNEL 凋亡數(shù)對照組1.8 ±1.9假手術組 2.7 ±2.2 IR組15min 3.7 ±1.52 h 18.8 ±3.8*6 h 53.3 ±5.3*24 h 106.8 ±7.4*2 d 41.2 ±4.1*4 d 31.7 ±4.9*16 d 20.0 ±5.1*

圖1 TUNEL假手術組 24 h，海馬CA1區(qū)凋亡的神經(jīng)元偶見(×400)

圖2 TUNELI/R 24 h，海馬CA1區(qū)凋亡的神經(jīng)元達高峰(×400)

圖3 TUNEL I/R+NS398組24 h，海馬CA1區(qū)凋亡的神經(jīng)元較I/R 24 h明顯減少(×400)

表2 大鼠I/R損傷后不同組24 h海馬區(qū)TUNEL凋亡數(shù)比較 n=12，

表2 大鼠I/R損傷后不同組24 h海馬區(qū)TUNEL凋亡數(shù)比較 n=12，

注:與假手術組比較，*P ＜0.05;與 I/R 24 h 組比較，#P ＜0.05

組別 TUNEL 凋亡數(shù)對照組1.8 ±1.9假手術組 2.7 ±2.2 I/R 24 h 組 106.8 ±7.4*I/R+NS39824 h 組 53.8 ±5.5*#

2.3 COX-2免疫組化形態(tài)觀察及定量分析結果 海馬CA1區(qū)COX-2陽性細胞胞漿著棕黃色。對照組、假手術組、I/R 15min海馬偶見COX-2免疫陽性細胞;I/R組COX-2免疫反應性在再灌后2 h開始升高，24 h達高峰;I/R+NS39824 h免疫反應性明顯減弱，與I/R 24 h差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3、4，圖4～6。

表3 大鼠I/R損傷后不同組不同時間海馬區(qū)COX-2表達比較 n=12，

表3 大鼠I/R損傷后不同組不同時間海馬區(qū)COX-2表達比較 n=12，

注:與假手術組比較，*P ＜0.05

組別OD對照組0.053 ±0.009假手術組 0.069 ±0.012 I/R組15min 0.081 ±0.0082 h 0.281 ±0.043*6 h 0.420 ±0.049*24 h 0.501 ±0.051*2 d 0.415 ±0.048*4 d 0.297 ±0.043*16 d 0.230 ±0.039*

表4 大鼠I/R損傷后不同組24 h海馬區(qū)COX-2表達比較 n=12，

表4 大鼠I/R損傷后不同組24 h海馬區(qū)COX-2表達比較 n=12，

注:與假手術組比較，*P ＜0.05;與 I/R 24h 比較，#P ＜0.05

組別OD對照組0.053 ±0.009假手術組 0.069 ±0.012 I/R 24 h 0.501 ±0.051*I/R+NS39824 h 0.308 ±0.033*#

圖4 COX-2假手術組 24 h，海馬CA1區(qū)偶見COX-2蛋白表達(SP×400)

圖5 COX-2I/R 24h，海馬CA1區(qū)COX-2表達達高峰(SP×400)

圖6 COX-2 I/R+NS39824 h組，海馬 CA1區(qū)COX-2表達強度比I/R組24 h減弱(SP×400)

3 討論

COX-2是催化花生四烯酸和血栓素的限速酶，是一種膜結合的分子量為71ku的糖蛋白，催化花生四烯酸氧化為前列腺素G2(PGG2)，再從PGG2還原為前列素H2(PGH2)，最終生成一系列PGs，引起炎性反應和介導炎性細胞毒性。全腦缺血后，海馬細胞死亡有許多細胞凋亡特征:如可被蛋白合成酶抑制劑所阻斷;具有凋亡細胞的一些形態(tài)學特征;產(chǎn)生DNA碎片以及促凋亡基因在死亡細胞中的選擇性表達等［2］。因此，全腦缺血后，在缺血神經(jīng)元凋亡的病理機制中，COX-2的過度表達和激活可能起很重要的作用。為了明確COX-2的過度表達是否引起腦缺血性神經(jīng)損害，該研究小組在此模型中應用了相對擇性COX-2抑制劑NS398，此藥物對動脈血壓、血糖、血氣和血紅蛋白無影響。結果表明，注射此藥物的實驗組動物缺血性腦梗死體積明顯小于對照組，有顯著性差異。此保護作用甚至在延遲給藥6 h后仍可觀察到，說明COX-2在神經(jīng)組織中的表達可直接損傷神經(jīng)元，并引起組織損傷和腦水腫。有資料顯示，COX-2參與I/R腦損傷區(qū)神經(jīng)元凋亡:已有研究證實，人類腦I/R使COX-2 mRNA上調(diào)并加重腦損傷的程度，引起細胞凋亡［3］;在 I/R 模型動物中 COX-2 可誘導大鼠神經(jīng)元凋亡［4］;使用COX-2特異性抑制劑，抑制海馬CA1區(qū)的DND［5］。

本實驗結果顯示:在腦I/R模型中，缺血組再灌后15min偶見凋亡細胞，2 h海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡開始增加，隨時間延長凋亡細胞逐漸增多，并于24 h達高峰;于16 d時仍可見凋亡細胞;COX-2免疫組化及免疫印跡所顯示的海馬區(qū)COX-2免疫活性在缺血1 h再灌后15min偶見，2 h升高，6 h明顯增強，24 h達高峰;于16 d時仍可見COX-2免疫活性;COX-2陽性細胞與TUNEL陽性細胞在分布區(qū)域上和細胞形態(tài)類型上有很大程度的重疊;使用COX-2的特異性阻制劑NS398，TUNEL陽性細胞數(shù)明顯減少。本研究發(fā)現(xiàn)COX-2可能通過促進神經(jīng)元凋亡參與I/R的發(fā)病，這為探索I/R的治療新途徑提供了理論基礎。

1 Zea-Longa E，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989，20:84-91.

2 Chen J，Zhu RL，Nakayama M，et al.Expression of the apoptosis effector gene，Bax，is up-regulated in vulnerable hippocampal CA1 neurons following globle ischemia.J Neurochem，1996，67:64-71.

3 Iadecola C，F(xiàn)orster C，Nogawa S，et al.Cyclooxygenase-2 immuno reactivity in the human brain following cerebral ischemia.Acta Neuropathol(Berl)，1999，98:9-14.

4 Takadera T，Yumoto H，Tozuka Y，et al.Prostaglandin E(2)in-duces caspase-dependentapoptosis in rat cortical cells.Neuros-ci Lett，2002，317:61-64.

5 Nakayama M，Uchimura K，Zhu RL，et al.Cyclooxygenase-2 inhibi-tion prevents delayed death of CA1 hippocampal neurons following global ischemia.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:10954-10959.