胡記妹，黃綽妤，曾軍榮，楊懷秀

（廣東省廣州市從化市中心醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510900）

己有研究證明我國嬰幼兒中存在諾瓦克樣病毒 （Nomvalk-like virus，NLV）和札幌樣病毒（Sapporo-like virus， SLV）兩種人類杯狀病毒（human calicivirus，HuCV）的感染，近年來我國杯狀病毒性腹瀉發(fā)生率呈上升趨勢，己在多個地區(qū)發(fā)生暴發(fā)流行[1]；由于不能早期干預(yù)，一些嬰幼兒由杯狀病毒感染引起損害及危及生命，給家庭及社會帶來巨大損失。從化地區(qū)是廣州的縣級城市，50多萬人口，周邊地區(qū)有眾多民工，人口聚集，極易暴發(fā)流行各病毒感染。2005年1月～2007年12月筆者在從化地區(qū)用RT-PCR方法檢測了非細(xì)菌性腹瀉病患兒糞便標(biāo)本的杯狀病毒，分析從化地區(qū)嬰幼兒杯狀病毒性胃腸炎的流行情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2005年1月～2007年12月，我院門診與住院診治的6 678名0～7歲就診腹瀉患兒，男3 361名，女3 317名。

1.2 標(biāo)本采集

2005年1月～2007年12月在廣東省廣州市從化巿中心醫(yī)院住院部和門診部兒科采集嬰幼兒非菌性腹瀉糞便標(biāo)本。

1.3 檢測前準(zhǔn)備工作

糞便標(biāo)本處理：加入1 ml樣品稀釋液（sample diluent）至1.5 ml EP管中，加入0.1 g固體糞便標(biāo)本或0.1 ml液體糞便標(biāo)本，置于漩渦震蕩器混勻，室溫靜置10 min，室溫下≥5 000 r/min離心5 min，備用。

1.4 病毒RNA提取

1.4.1 提取前的準(zhǔn)備工作 ①將1 ml Buffer AVL加入裝有低壓凍干的Carrier RNA中，徹底溶解Carrier RNA后，將溶有Carrier RNA的Buffer AVL轉(zhuǎn)入至Buffer AVL瓶中，徹底混勻。分裝貯存于2～8℃。如果在2～8℃時，Buffer AVL/Carrier RNA溶液形成沉淀，可在80℃重新溶解，注意加熱的時間不能超過5 min，用前冷卻至室溫。Buffer AVL/Carrier RNA溶液不能加熱超過6次。②加入合適比例的96%～100%的酒精至Buffer AW1中，19 ml的Buffer AW1加入酒精25 ml。③加入合適比例的96%～100%的酒精至Buffer AW2中，13 ml的Buffer AW2加入酒精30 ml。

1.4.2 病毒RNA的提取 ①在1.5 ml EP管中加入560μl已加入Carrier RNA的Buffer AVL。②將140μl 10%便懸液加入至EP管中的Buffer AVL中，vortex混勻15 sec。③室溫（15～25℃）孵育10 min。④將1.5 ml EP管輕微離心，以去除管內(nèi)的液滴。⑤在管內(nèi)加入560μl 96%～100%的酒精，vortex混勻15 sec。混勻后，將1.5 ml EP管輕微離心，以去除管內(nèi)的液滴。⑥小心地將630μl步驟⑤中的溶液加入至已放入2 ml收集管中的QIAamp離心柱中，注意不要弄濕柱子邊緣。蓋上蓋子，8 000 r/min離心1 min。將QIAamp離心柱放置至另一干凈的2 ml收集管中，棄去包含有濾過液的收集管。⑦小心打開QIAamp離心柱的蓋子，重復(fù)步驟⑥。⑧小心打開QIAamp離心柱的蓋子，加入500μl Buffer AW1。蓋上蓋子，8 000 r/min離心1 min。將QIAamp離心柱放置至另一干凈的2 ml收集管中，棄去包含有濾過液的收集管。⑨小心打開 QIAamp離心柱的蓋子，加入 500μl Buffer AW2。蓋上蓋子，14 000 r/min離心3 min。棄去收集管中的濾過液，14 000 r/min離心空柱子1 min。⑩將QIAamp離心柱放置入干凈的1.5 ml離心管中。棄去包含有濾過液的收集管。小心打開QIAamp離心柱的蓋子，加入60μl Buffer AVE至離心柱中，蓋上蓋子，室溫孵育1 min。8 000 r/min離心1 min。（2×40μl的Buffer AVE洗脫 2次，能增加產(chǎn)量。）病毒 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，或貯存于-20℃或-70℃?zhèn)溆茫靡镄蛄袇⒁娢墨I(xiàn)[2]。

2 結(jié)果

2.1 HuCV感染情況分布

6 678名0～7歲腹瀉患兒中898例大便檢測出HuCV，檢出率為13.45%，見表1。

表1 2005年1月～2007年12月小兒腹瀉HuCV感染情況分布（例）

2.2 不同性別、年齡與HuCV感染的關(guān)系

在3 361例男性腹瀉患兒中有455例HuCV陽性，占13.54%，3 317名女性腹瀉患兒中有443例HuCV陽性，占13.36%，各年齡組患兒的大便均檢測出HuCV，以6個月～3歲年齡組分布較多，見表2。

表2 小兒腹瀉HuCV感染年齡及性別分布情況

3 討論

近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，病原檢測手段不斷提高，國外文獻(xiàn)對人類杯狀病毒與疾病的關(guān)系已有較全面的研究報道，目前認(rèn)為是除輪狀病毒外造成腹瀉的最重要的病毒病原；在我國對輪狀病毒感染的研究較多，輪狀病毒感染是嬰幼兒非細(xì)菌性腹瀉的主要病原，發(fā)展中國家每年有60萬～70萬名兒童死于重型輪狀病毒腹瀉[3-6]。本資料結(jié)果顯示：0～7歲腹瀉患兒的大便HuCV陽性率為13.45%；與文獻(xiàn)報道相一致[7]。HuCV流行的一般特點：HuCV存在多種傳播途徑，即人-人傳播、食物傳播、水源傳播，其中人-人傳播又可分為糞-口傳播和嘔吐物的氣溶膠傳播[8]。由于HuCV感染劑量低（＜100病毒顆粒）、缺乏持續(xù)的免疫力且人群對HuCV普遍易感、存在多種潛在傳播途徑等，導(dǎo)致HuCV感染極易形成暴發(fā)。

HuCV感染在10～12月期間發(fā)生率較高，達(dá)694例，占77.28%以上，與其他時間段差異顯著。HuCV感染在6個月～3歲為高峰期，與其他組比較差異顯著?？赡芘c嬰幼兒期的喂養(yǎng)方式有關(guān)：6個月以內(nèi)的嬰兒多為母乳喂養(yǎng)，母乳中存在HuCV抗體、胰蛋白酶抑制劑、非免疫球蛋白性病毒抑制劑[9]，不易感染HuCV，且母乳喂養(yǎng)兒腸道中存在著一定數(shù)量的細(xì)菌群，主要是雙歧桿菌，腸道正常菌群的存在能抑制HuCV的感染；另外嬰幼兒期體內(nèi)來自母體的獲得性抗體在6個月以后漸漸消失，而自身的免疫系統(tǒng)尚未建立，機體對HuCV抵抗力減弱有關(guān)，所以發(fā)生率較高。6歲以后，隨著自身的免疫系統(tǒng)的建立，機體對HuCV抵抗力增強，發(fā)生率顯著降低。

HuCV腹瀉患兒的臨床資料分析表明，HuCV感染的臨床癥狀與輪狀病毒相似，以腹瀉為主，約半數(shù)患兒伴有嘔吐，并有不同程度的發(fā)熱和腹痛等癥狀，部分患兒存在輕度到中度脫水，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重脫水，均未見抽搐、休克等嚴(yán)重并發(fā)癥。檢測結(jié)果也表明廣州地區(qū)嬰幼兒腹瀉病主要是杯狀病毒，杯狀病毒已成為繼輪狀病毒之后嬰幼兒腹瀉的重要病原體，分型引物RT-PCR法能夠快速進(jìn)行杯狀病毒分組和鑒定，廣泛適用于杯狀病毒分子流行病學(xué)研究，為更好地預(yù)防和控制杯狀病毒腹瀉提供依據(jù)。

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