李嫚,宋艷玲,王夢嵽,梅元武,黎剛,方瑗

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢430032

電針有疏通經(jīng)脈、調(diào)理氣血的作用,能擴(kuò)張血管,促進(jìn)血栓的溶解吸收,作為缺血性腦血管病的非藥物療法之一,其卓越療效已得到驗(yàn)證。被公認(rèn)可用于腦血管病恢復(fù)期的治療,有學(xué)者認(rèn)為電針治療在缺血再灌注損傷后早期進(jìn)行療效更佳[1],但早期何時(shí)開始治療療效最佳尚無定論。本研究通過觀察大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)開始電針治療,對凋亡調(diào)控相關(guān)因子B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因-2(B-cell lymphoma gene-2,Bcl-2)mRNA轉(zhuǎn)錄和半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(caspase-3)表達(dá)的影響,初步尋找電針治療腦梗死的最佳時(shí)間窗,并探討可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:12周齡雄性SD大鼠100只,體質(zhì)量(250±30)g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。②主要試劑與材料:Trizol(購于Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(購于 Promega公司),SYBR Green I(購于 Biotium公司),兔抗 caspase-3單克隆抗體、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(購于武漢博士德生物工程有限公司),5810R臺式高速大容量離心機(jī)(購于 Eppendorf公司),7700型熒光定量PCR儀(購于ABI公司),引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 局灶性腦缺血再灌注模型制備及分組 100只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組及電針組,各組再根據(jù)術(shù)后開始針刺治療的時(shí)間點(diǎn),分為術(shù)后 6 h、12 h、24 h、48 h及72 h共5個(gè)亞組,每亞組5只大鼠。參照廖維靖等[2]介紹的改良Zea Longa線栓法制作左側(cè)大腦中動脈栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)動物模型(模型組及電針組)。假手術(shù)組大鼠手術(shù)操作與模型組及電針組相同,但術(shù)中不阻斷大腦中動脈血流。正常組不給予任何手術(shù)處理。

1.2.2 穴位定位及電針干預(yù) 根據(jù)大鼠針灸穴位定位法[3]及擬人比照法定位,選取百會、大椎穴。醫(yī)用15 mm,28號毫針刺入穴位,接G6805-2型電針儀,同一輸出電極接同側(cè)兩穴。刺激參數(shù):疏密波,疏波2 Hz,密波30 Hz,電流強(qiáng)度2 mA,輸出電壓2～4 V,以局部輕顫為度,刺激時(shí)間30 min/次,針刺分別在造模后 6 h、12 h、24 h 、48 h 、72 h 開始,2次/d(9∶00和17∶00),連續(xù)14 d。其它 3組僅作相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)捆扎,不進(jìn)行針刺。

1.2.3 大鼠梗死灶Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測 各組實(shí)驗(yàn)大鼠于治療14 d后深度麻醉,冰盤上快速斷頭取腦,切取梗死灶周邊腦組織約100 mg,加入 Trizol溶液0.5 mL,常規(guī)方法提取mRNA,紫外分光光度計(jì)測定其濃度及純度;在逆轉(zhuǎn)錄酶M-M LV作用下,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA分子,采用 SYBR Green I熒光染料技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR),以獲取各組標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用計(jì)算機(jī)分析Ct值。引物設(shè)計(jì)序列如下:Bcl-2上游引物:5'-GGGACGCGAAGTGCTATTGGTA-3';下游引物:5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATGC-3'。

1.2.4 大鼠梗死灶caspase-3蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測 各組實(shí)驗(yàn)大鼠于治療14 d后斷頭取腦,常規(guī)石蠟包埋、切片(連續(xù)4 μ m冠狀切片5張備用)。取相同層面的2張切片,SABC法檢測caspase-3蛋白的表達(dá)。一抗為兔抗caspase-3單克隆抗體(1∶100稀釋),二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG,顯色后光鏡下觀察。caspase-3陽性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃染色顆粒。

1.2.5 圖像分析 每張切片取梗死側(cè)不重復(fù)的5個(gè)視野照相,LEICA Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析,檢測其灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以(±s)表示,主效應(yīng)及交互效應(yīng)統(tǒng)計(jì)選用多組重復(fù)測量方差分析;單獨(dú)效應(yīng)分析選用單因素方差分析及單組重復(fù)測量資料方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較結(jié)果 正常組及假手術(shù)組各亞組組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;模型組及電針組各亞組與正常組及假手術(shù)組相同時(shí)間點(diǎn)各亞組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);電針組與模型組各相同時(shí)間點(diǎn)亞組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。正常組、假手術(shù)組及模型組各亞組組內(nèi)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;電針組各亞組組內(nèi)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),以術(shù)后12 h亞組Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對較高,見表1。

2.2 各組大鼠caspase-3蛋白表達(dá)水平比較結(jié)果 正常組及假手術(shù)組各亞組組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;模型組及電針組各亞組與正常組及假手術(shù)組相同時(shí)間點(diǎn)各亞組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);電針組與模型組各相同時(shí)間點(diǎn)亞組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。正常組、假手術(shù)組及模型組各亞組組內(nèi)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;電針組各亞組組內(nèi)(除12 h和24 h亞組之間外)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),以術(shù)后24 h亞組caspase-3蛋白表達(dá)水平相對較低,見表2。

3 討論

在有效時(shí)間內(nèi)采取合適的治療可抑制缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡。電針治療腦梗死的療效已得到肯定[4],有學(xué)者認(rèn)為急性期療效優(yōu)于恢復(fù)期和后遺癥期[5]。但亦有研究表明急性期開始電針治療并非越早越好,可能存在一個(gè)最佳的治療時(shí)間窗[6],但何時(shí)為最佳時(shí)間窗尚無定論。

caspase-3是最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶,在缺血性腦梗死中抑制caspase-3活性可明顯的減少神經(jīng)元的凋亡[7]。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測caspase-3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)電針組caspase-3的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均低于模型組,且24 h亞組表達(dá)最低。

細(xì)胞凋亡是由多個(gè)基因參與調(diào)控的非炎癥性死亡,目前認(rèn)為Bcl-2是與腦缺血神經(jīng)元凋亡關(guān)系最密切的內(nèi)源性凋亡抑制基因,它所編碼的膜相關(guān)蛋白是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞死亡抑制因子。Bcl-2可能通過干擾Ca2+釋放,阻止線粒體細(xì)胞色素C釋放,抗氧化抑制自由基產(chǎn)生等機(jī)制發(fā)揮抗凋亡作用。研究表明,Bcl-2可在大鼠腦缺血過程中廣泛表達(dá)[8],且其過度表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱苷肽的積聚,導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變,降低caspase的活性。本研究結(jié)果顯示,電針組Bcl-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在各時(shí)間點(diǎn)均高于模型組,且12 h亞組轉(zhuǎn)錄水平最高。

表1 各組大鼠腦梗死灶Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較(±s)

表1 各組大鼠腦梗死灶Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較(±s)

與相同時(shí)間點(diǎn)電針組各亞組比較,①P＜0.05;與相同時(shí)間點(diǎn)模型組各亞組比較,②P＜0.05

?

表2 各組大鼠腦梗死灶caspase-3蛋白表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組大鼠腦梗死灶caspase-3蛋白表達(dá)水平比較(±s)

與相同時(shí)間點(diǎn)電針組各亞組比較,①P＜0.05;與相同時(shí)間點(diǎn)模型組各亞組比較,②P＜0.05

?

筆者推斷電針可能通過促進(jìn)凋亡抑制因子的表達(dá)并且抑制促凋亡因子的表達(dá)來減少缺血半暗帶神經(jīng)元的凋亡,發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能與抑制腦梗死后caspase-3蛋白的表達(dá),刺激Bcl-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。此外,電針促進(jìn)腦梗死后康復(fù)的機(jī)制還有改善局部微循環(huán)和代謝,維持細(xì)胞內(nèi)外離子穩(wěn)態(tài),對抗自由基損傷及脂質(zhì)過氧化反應(yīng),調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)等[9]。筆者推測電針治療腦梗死于急性期開始療效最好,且在其急性期存在一個(gè)最佳的治療時(shí)間窗。

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