張華軍,徐格林,劉新峰#

1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,南京 210008;2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,南京210002

神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)基本結(jié)構(gòu)單位,神經(jīng)膠質(zhì)細胞作為另一種細胞類型,在神經(jīng)元的生長發(fā)育和修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。星形膠質(zhì)細胞(astrocytes,ACs)是哺乳動物CNS內(nèi)分布最廣泛的膠質(zhì)細胞之一,主要功能是為神經(jīng)元提供營養(yǎng)和能量物質(zhì),促進神經(jīng)元生長、發(fā)育和修復(fù)。ACs可通過分泌可溶性因子介導(dǎo)神經(jīng)保護功能[1-3]。

嗅鞘細胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是存在于嗅覺系統(tǒng)的特殊類型膠質(zhì)細胞,可促進成年哺乳動物嗅感覺神經(jīng)元不斷更新,促進多種CNS神經(jīng)元存活和軸突生長[4-6]。OECs這些功能部分源于OECs分泌的多種營養(yǎng)物質(zhì)[7-9]。

本研究分別采用嗅鞘細胞條件培養(yǎng)液(olfactory ensheathing cells conditioned medium,OECCM)和星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液(astrocytes conditioned medium,ACM)預(yù)處理受損的海馬神經(jīng)元,對比2種條件培養(yǎng)液對受損海馬神經(jīng)元活力、凋亡率和胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度的影響,旨在從膠質(zhì)細胞分泌的角度研究嗅鞘細胞和星形膠質(zhì)細胞對受損海馬神經(jīng)元的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:成年 SD大鼠 80只,雌雄不限,體質(zhì)量 180～220 g,出生 24 h內(nèi)的SD大鼠80只,雌雄不限,由南京軍區(qū)總院實驗動物中心提供。②主要試劑與材料:DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、Neurobasal培養(yǎng)基、50×B27添加劑(購于Gibco公司);四氮甲唑藍(M TT)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4,6-Diamidino-2-Phenylindole,DAPI)和Fluo-3/AM(購于Sigma公司);磷脂結(jié)合蛋白Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(購于Biovision公司);膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein,GFAP)(購于Chemicon公司);截留分子量為5KD的超濾離心管(購于Millipore公司);兔抗神經(jīng)生長因子低親和力受體(low affinity nerve grow th factor receptor,p75NTR)抗體(購于Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 嗅鞘細胞培養(yǎng)與鑒定 成年健康SD大鼠,常規(guī)消毒,無菌環(huán)境下迅速完整取出雙側(cè)嗅球,解剖顯微鏡下輕輕剝?nèi)バ崆蛲獍坏难苣?分離出外2層(嗅神經(jīng)層及顆粒層)置于冰浴解剖液中,剪碎組織塊,加入胰酶消化。加入等體積的含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化,輕輕吹打,制成細胞懸液,按細胞密度為1×106/mL接種于無菌培養(yǎng)瓶中,移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。差速貼壁法[10]純化嗅鞘細胞,培養(yǎng)10 d,經(jīng)p75NTR和DAPI免疫細胞化學(xué)雙染,鑒定嗅鞘細胞純度。

1.2.2 海馬星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)與鑒定 取成年健康SD大鼠,參照Lin等[2]的方法培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞10 d,經(jīng)GFAP和DAPI免疫細胞化學(xué)雙染鑒定星形膠質(zhì)細胞純度。

1.2.3 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)和谷氨酸損傷模型制作 取出生 24 h內(nèi)的SD大鼠,參照Brewer等[11]的方法,采用海馬專用無血清培養(yǎng)基(添加B27的Neurobasal培養(yǎng)基)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,取培養(yǎng)7 d的細胞,經(jīng)NSE和DAPI免疫細胞化學(xué)雙染鑒定神經(jīng)元。根據(jù)本課題組預(yù)試驗結(jié)果,選取0.5 mM 的谷氨酸濃度制作神經(jīng)元損傷模型。

1.2.4 ACM和OECCM的收集和濃縮ACM和OECCM的收集均取自生長狀態(tài)良好、培養(yǎng)第10天的嗅鞘細胞和星形膠質(zhì)細胞,按照1×106/mL重新接種細胞,經(jīng)12 h細胞貼壁后,Hanks液清洗2次,加入添加B27的Neurobasal培養(yǎng)基3 mL培養(yǎng)48 h,收集上清液,-80℃保存。收集完畢后,統(tǒng)一采用超濾離心管,低溫離心,濃縮OECCM和ACM,-80℃保存。

1.2.5 分組 ①正常組:培養(yǎng)第8天的海馬神經(jīng)元經(jīng)Hanks液清洗2次后,換為海馬專用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。②谷氨酸組:培養(yǎng)第8天的海馬神經(jīng)元用終濃度為0.5 mM的谷氨酸作用0.5 h后,換為海馬專用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)23.5 h。③OECCM 組:培養(yǎng)第7.5天的海馬神經(jīng)元用OECCM預(yù)先孵育12 h,加入終濃度為0.5 mM的谷氨酸作用0.5 h,Hanks液清洗2次,換為海馬專用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)23.5 h。④ACM 組:培養(yǎng)第7.5天的海馬神經(jīng)元用ACM預(yù)先孵育12 h,加入終濃度為0.5 mM的谷氨酸作用0.5 h,Hanks液清洗2次,換為海馬專用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)23.5 h。

1.2.6 海馬神經(jīng)元活力檢測 預(yù)先接種在96孔板中的海馬神經(jīng)元,經(jīng)以上干預(yù)后,每孔加入MTT溶液20 μ L,37℃繼續(xù)孵育4 h,棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加 DMSO 150 μ L,震蕩10 min,上酶標(biāo)儀,選擇490 nm波長測各孔OD值。每組取5個樣本,重復(fù)檢測3次。檢測得到的OD值與細胞活力呈正相關(guān)。

1.2.7 Annexin-V/PI雙染流式細胞儀檢測凋亡率 消化以上各組海馬神經(jīng)元,調(diào)整細胞密度到1×106/mL,移入無菌離心管中,1500 rpm 離心5 min,棄上清;用0.01 M PBS 1 mL洗滌離心,棄上清;再次加入500 μ L緩沖液,振蕩后,加入Annexin-V和PI溶液各2 μ L,避光,孵育10 min,上流式細胞儀檢測。每組取5個樣本,重復(fù)檢測3次。

1.2.8 神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度檢測消化各組海馬神經(jīng)元,將細胞密度調(diào)整到1×106/mL,移入無菌離心管中,1500 rpm離心5 min,棄上清;加入含鈣鎂的PBS液和終濃度為 5 mmol/L的 Fluo-3/AM,避光37℃,5%CO2孵育30 min,洗滌離心,棄上清;再次加入含鈣鎂的 PBS緩沖液500 μ L振蕩后,上機檢測。另設(shè)2組細胞懸液,1組加入熒光淬滅劑M nCL2,檢測結(jié)果為Fmin;1組加入CaCL2,檢測結(jié)果為Fmax。按下列公式計算細胞內(nèi)游離鈣離子濃度:[Ca2+]i=Kd×[(F-Fmin)/(Fmax-F)]。Kd=450 nmol/L,為Fluo-3與Ca2+的解離常數(shù),以nmol/L為單位表示。每組取5個樣本,重復(fù)檢測3次[12-14]。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細胞純度鑒定結(jié)果 培養(yǎng)的嗅鞘細胞、海馬星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元純度均達到95%。

2.2 海馬神經(jīng)元活力測定結(jié)果 與正常組相比,OECCM組神經(jīng)元活力降低(P＜0.05),谷氨酸組、ACM組神經(jīng)元活力均明顯降低(P＜0.01);與谷氨酸組相比,OECCM組神經(jīng)元活力明顯增高(P＜0.01),ACM組神經(jīng)元活力增高(P＜0.05);與OECCM組相比,ACM組神經(jīng)元活力降低(P＜0.05),見圖 1。

圖1 不同條件培養(yǎng)液對海馬神經(jīng)元活力的影響 與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與谷氨酸組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01;與OECCM組比較,#P＜0.05

2.3 神經(jīng)元凋亡檢測結(jié)果 與正常組相比,OECCM組神經(jīng)元的凋亡率升高(P＜0.05),谷氨酸組、ACM組神經(jīng)元的凋亡率明顯升高(P＜0.01);與谷氨酸組相比,ACM組神經(jīng)元的凋亡率降低(P＜0.05),OECCM組明顯降低(P＜0.01);OECCM組神經(jīng)元的凋亡率低于ACM 組(P＜0.05),見表1。

2.4 細胞內(nèi)游離鈣離子濃度檢測結(jié)果 與正常組相比,OECCM組神經(jīng)元的胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高(P＜0.05),谷氨酸組、ACM組神經(jīng)元的胞內(nèi)游離鈣離子濃度明顯升高(P＜0.01);與谷氨酸組相比,ACM組的胞內(nèi)游離鈣離子濃度降低(P＜0.05),OECCM組神經(jīng)元的胞內(nèi)游離鈣離子濃度明顯降低(P＜0.01);OECCM組神經(jīng)元的胞內(nèi)游離鈣濃度低于ACM 組(P＜0.05),見表1。

表1 不同條件培養(yǎng)液對海馬神經(jīng)元的凋亡率和胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響(±s)

表1 不同條件培養(yǎng)液對海馬神經(jīng)元的凋亡率和胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響(±s)

與正常組比較,①P＜0.05,②P＜0.01;與谷氨酸組比較,③P＜0.05,④P＜0.01;與OECCM 組比較,⑤P＜0.05

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3 討論

神經(jīng)元的生長發(fā)育受各種因子調(diào)節(jié),多種神經(jīng)營養(yǎng)因子對受損神經(jīng)元起保護作用,如神經(jīng)生長因子(nerve grow th factor,NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、胰島素樣生長因子等。盡管膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液中成分不十分明確,但研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細胞分泌的可溶性因子介導(dǎo)神經(jīng)保護作用。作為2種不同的膠質(zhì)細胞,研究證實嗅鞘細胞和星形膠質(zhì)細胞均通過分泌方式發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

本研究通過對細胞活力、神經(jīng)元凋亡率和細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的研究發(fā)現(xiàn):2種膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中存在活性成分,可以減輕谷氨酸對神經(jīng)元的損傷,延緩其損傷發(fā)展,保護受損神經(jīng)細胞;與ACM相比,OECCM的神經(jīng)保護作用更佳。Feng等[15]研究發(fā)現(xiàn):6-羥基多巴胺致PC12細胞的凋亡可被OECCM阻斷,可能是OECCM通過上調(diào)Bcl-2,下調(diào)Bax的通路發(fā)揮作用。近期研究發(fā)現(xiàn)OECCM刺激海馬神經(jīng)元的存活、并提高軸突密度,并發(fā)現(xiàn)OECCM作為神經(jīng)因子的來源與添加膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和NGF等有所不同[16]。以上結(jié)果也證實本研究的結(jié)論,即嗅鞘細胞分泌的因子在神經(jīng)功能修復(fù)和神經(jīng)重塑方面具有優(yōu)勢。

目前有許多OECCM和ACM神經(jīng)保護作用的報道[1-3,7-9,17-19],但關(guān)于嗅鞘細胞和星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元保護作用的對比研究尚未見報道,本研究有助于進一步評價不同膠質(zhì)細胞通過外分泌產(chǎn)生的神經(jīng)保護作用。本研究認為OECCM可能分泌更適合神經(jīng)元存活的物質(zhì),結(jié)合前期的研究發(fā)現(xiàn)[20-21],本課題組將會進行進一步的研究,以明確ACM和OECCM中的具體營養(yǎng)成分,以及產(chǎn)生這種差別的原因。推測ACM和OECCM神經(jīng)保護的原因可能通過促進神經(jīng)元內(nèi)鈣結(jié)合蛋白Calbindin-D28k的表達而拮抗鈣超載。Lin等[2]的研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞對于缺血腦細胞的保護作用不僅依賴于星形膠質(zhì)細胞釋放的各種因子,而且與受損細胞表面受體的變化相關(guān),如缺血神經(jīng)元表面的神經(jīng)營養(yǎng)因子-3受體增加,缺血星形膠質(zhì)細胞的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體增加。這些研究結(jié)果也提供新思路,即細胞表面受體的變化是否也會影響神經(jīng)保護作用,同時也有助于進一步開展對膠質(zhì)細胞的神經(jīng)保護研究。

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