汪琦,徐逸,王偉 ,朱舟

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)科,武漢430030

趨化因子(chemokine)是一類小分子量的分泌蛋白,在炎癥和免疫反應(yīng)中起重要作用。根據(jù)其N末端2個(gè)半胱氨酸殘基的空間位置不同可分為CXC、CC、C和CXC3C亞族。CXCL12屬于CXC亞族,其cDNA最初由小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞克隆而來,故也被命名為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)。CXCR4為CXCL12的受體,兩者之間為一對一關(guān)系。在外周免疫系統(tǒng)中,CXCL12發(fā)揮多種重要作用[1,2]。此外,骨髓來源前體細(xì)胞(干細(xì)胞)能夠順CXCL12濃度梯度到相應(yīng)部位,參與造血前體細(xì)胞向骨髓的歸巢、血液和淋巴系統(tǒng)、血管、小腦和感覺側(cè)索等組織的胚胎發(fā)育[3-8]、類風(fēng)濕疾病[9]、腫瘤的生長、發(fā)育和轉(zhuǎn)移[10]等。

CXCL12和CXCR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中廣泛表達(dá)。在HIV相關(guān)腦病[11,12]、腦腫瘤[13]、卒中[14]等CNS疾病中,CXCR12可能發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,CXCR12還參與多種神經(jīng)退行性疾病的病理過程,如阿爾茨海默病(Alzheimer's disese,AD)[15,16]等。本文擬構(gòu)建含CXCL12和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究CXCL12在CNS疾病發(fā)病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑與材料:Adeno-XTMExpression System 1(購于Clontech公司);含CXCL12全長cDNA質(zhì)粒pmCherry-CXCL12由美國Northwestern University大學(xué)Richard J.Miller教授惠贈(該質(zhì)粒同時(shí)帶有紅色熒光蛋白mCherry基因和小鼠CXCL12基因);限制性內(nèi)切酶 Nhe I、Not I、Apa I、Xho I,PCR試劑盒,T4連接酶(購于日本Fermentas公司);限制性內(nèi)切酶Pac I(購于NEB公司);質(zhì)粒小量提取試劑盒(購于美國Omega公司);小量膠回收試劑盒(購于上海華舜生物公司);陽離子脂質(zhì)體Clonfectin(購于 Clontech公司);高糖 DMEM 培養(yǎng)基,胎牛血清、小牛血清(購于 Hyclone公司);凍存293細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存;Olympus IX81型熒光倒置顯微鏡(購于Olympus公司)。

1.2 構(gòu)建含有目的基因的質(zhì)粒 將pm-Chenry-CXCL12和pEGFP-N1經(jīng)Not I和Apa I酶切后相連,構(gòu)建成為表達(dá)綠色熒光的目的基因pEGFP-CXCL12。

1.3 穿梭質(zhì)粒pShuttle2-EGFP-CXCL12的構(gòu)建 pEGFP-CXCL12和 pShuttle2均經(jīng)Nhe I和 Not I雙酶切,用連接酶連接成pShuttle2-EGFP-CXCL12,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,鋪板、挑單菌落、擴(kuò)增并酶切和測序鑒定。同時(shí)將空載體pEGFP-N1和pShuttle2均經(jīng)Nhe I和Not I雙酶切,用連接酶連接成pShuttle2-EGFP作為對照。

1.4 重組腺病毒質(zhì)粒 pAdeno-EGFP-CXCL12的構(gòu)建及鑒定 將pShuttle2-EGFPCXCL12和pShuttle2-EGFP分別用I-Ceu I和PI-Sce I雙酶切后,回收2.1kb和1.8kb的酶切片段,各自與Adeno-XTMExpression System試劑盒中的腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeno-X(已用I-Ceu I和PI-Sce I切開)連接,得到pAdeno-EGFP-CXCL12和pAdeno-EGFP,按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5α,鋪板、挑單菌落、擴(kuò)增提取,酶切鑒定。

1.5 重組腺病毒載體Ad-EGFP-CXCL12的包裝及鑒定 大量提取重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-EGFP-CXCL12,Pac I酶切成線性,酚氯仿異戊醇抽提純化,用 1 μ g/μ L Clonfectin 脂質(zhì)體 10 μ L 和100 μ L無血清無抗生素OPT-MEM 培養(yǎng)基混合,將6 μ g Pac I酶切線性化產(chǎn)物與100 μ L OPT-M EM 培養(yǎng)基混合,將 200 μ L Clonfectin/DNA 混合物轉(zhuǎn)染六孔板內(nèi)50%～70%生長融合的293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞EGFP的表達(dá)情況,觀察細(xì)胞形態(tài),當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí),-80℃/37℃反復(fù)凍融3次,裂解細(xì)胞收集病毒作為原代重組腺病毒用于大量擴(kuò)增。抽提病毒DNA為模板,以CXCL12cDNA內(nèi)1段225 bp的序列設(shè)計(jì)引物,上游引物 5'-ACGCCAAGGTCGTCG CCGTGC-3',下游引物5'-TAATTTCGGGTCAATGCACAC-3',反應(yīng)條件94℃45 s,55℃40 s,72℃45 s,30個(gè)循環(huán),最后72℃10 min延伸,對病毒進(jìn)行鑒定。同時(shí)擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參,片段長度594 bp,上游引物5'-CCTTCATTGACCTCAACTAC-3',下游引物5'-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3',反應(yīng)條件同前。

2 結(jié)果

2.1 穿梭質(zhì)粒pShuttle2-EGFP-CXCL12的鑒定 挑菌落擴(kuò)增,提取重組質(zhì)粒。pShuttle2-EGFP-CXCL12經(jīng)EcoR I單酶切后電泳,完全酶切結(jié)果為1.3 kb和3.8 kb的條帶各1條;對照空載質(zhì)粒pShuttle2-EGFP經(jīng)EcoR I單酶切后,完全酶切結(jié)果為0.7 kb和4 kb的條帶各1條,見圖1。經(jīng)I-Ceu I和PI-Sce I酶切后,pShuttle2-EGFP-CXCL12得到2.1 kb和2.9 kb條帶各1條,pShuttle2-EGFP得到1.8 kb和2.9 kb條帶各1條,見圖2。鑒定后將pShuttle2-EGFP-CXCL12菌液測序,所測序列與Genebank的序列完全一致,見圖3。

2.2 重組腺病毒質(zhì)粒 pAdeno-EGFP-CXCL12的鑒定 氨芐青霉素篩選后,擴(kuò)增存活菌落提取質(zhì)粒,Xho I酶切,電泳觀察結(jié)果。沒有重組的腺病毒骨架pAdeno-X酶切條帶分布是 14.5 kb、8 kb、5.7 kb、2.5 kb、1.4 kb、0.6 kb,重組的腺病毒質(zhì)粒pAdeno-EGFP-CXCL12經(jīng)完全酶切結(jié)果為14.5 kb、8 kb、4.4 kb、2.6 kb、2.5 kb(2.5 kb和2.6 kb條帶重合)、1.4 kb 、0.6 kb(DNA 濃度低不可見);重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-EGFP經(jīng)完全酶切結(jié)果為14.5 kb、8 kb、7.6 kb(7.6 kb和 8 kb 重合)、2.5 kb、1.4 kb、0.6 kb(DNA濃度低不可見),見圖4。

圖4 pAdeno-X(條帶1)、pAdeno-EGFP-CXCL12(條帶 2)及 pAdeno-EGFP(條帶 3)經(jīng) Xho I酶切后電泳結(jié)果

2.3 重組腺病毒載體Ad-EGFP-CXCL12的包裝及鑒定 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pAdeno-EGFPCXCL12入293細(xì)胞后48 h,熒光倒置顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有 EGFP的表達(dá),逐漸增多,并有部分 EGFP表達(dá)呈彗星狀分布,見圖5A-B。第4～5天,293細(xì)胞出現(xiàn)收縮、變圓等病理改變,第9～10天細(xì)胞出現(xiàn)噬斑,噬斑周圍病變細(xì)胞呈圓形,聚集成葡萄狀,第12天有部分細(xì)胞剝離。細(xì)胞經(jīng)裂解后,離心獲得含病毒上清,以病毒DNA為模板,PCR擴(kuò)增出225 bp的特異性條帶,見圖6。

3 討論

CXCR4廣泛分布于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞,CXCL12主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌。在生理情況下,CXCL12/CXCR4參與CNS的發(fā)育、神經(jīng)干細(xì)胞的遷移和增殖,促使星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌谷氨酸,參與多巴胺分泌等,在神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)及神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞-膠質(zhì)細(xì)胞之間的信息溝通中發(fā)揮重要作用。在某些病理情況下,如HIV相關(guān)癡呆、腦梗死、多發(fā)性硬化等,CXCL12的表達(dá)明顯上調(diào)或下調(diào),提示該趨化因子參與這些疾病的病理過程。

骨髓來源的干細(xì)胞能夠被動員進(jìn)入外周循環(huán),并在特定的組織環(huán)境下分化為組織特異的細(xì)胞系[17]。在CNS,骨髓來源的干細(xì)胞能夠穿過血-腦脊液屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì),尤其在病理情況下,如AD、腦梗死等,骨髓來源的干細(xì)胞能夠被趨化到病灶周圍,參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[14,18]。由于骨髓來源干細(xì)胞重要的治療價(jià)值,其趨化調(diào)節(jié)的機(jī)制受到越來越多的關(guān)注。

骨髓干細(xì)胞向外周組織的趨化受到多種因素的精細(xì)調(diào)節(jié),其中最重要的調(diào)節(jié)因素之一就是趨化因子,CXCL12是其中的重要成員。研究發(fā)現(xiàn),在腦梗死中CXCL12表達(dá)增加,并與梗死區(qū)單核細(xì)胞的浸潤相關(guān),提示CXCL12參與腦梗死的炎癥過程[21]。CXCL12還參與調(diào)節(jié)骨髓來源干細(xì)胞向腦梗死區(qū)和脊髓損傷區(qū)域的募集,這些被募集的干細(xì)胞在特定微環(huán)境可能分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞,幫助神經(jīng)功能重建[19-21]。在AD的研究中發(fā)現(xiàn),AD患者血清和腦脊液中 CXCL12水平下降,提示在AD患者CNS中缺乏造血干細(xì)胞的支持,不利于神經(jīng)功能修復(fù)[15];研究還發(fā)現(xiàn)骨髓造血干細(xì)胞能夠穿過血-腦脊液屏障,并分化為具有高效吞噬功能的小膠質(zhì)細(xì)胞[18],促進(jìn)Aβ清除,CXCL12可能參與這類骨髓來源的小膠質(zhì)細(xì)胞向CNS的趨化。盡管各種研究提示CXCL12參與許多CNS疾病的病理過程,但具體的機(jī)制目前尚不清楚,明確CXCL12在這些疾病中的作用可能為疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。

本研究成功構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體Ad-CXCL12-EGFP,該腺病毒表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞能夠模擬CNS內(nèi)的CXCL12表達(dá)上調(diào),由于同時(shí)連接 EGFP作為報(bào)告基因,適用于固定后和其他熒光標(biāo)記進(jìn)行多標(biāo)實(shí)驗(yàn),并可通過熒光表達(dá)強(qiáng)度了解目的基因CXCL12的表達(dá)。

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