陸學勝,許敏,張燕,姚勝旗,張允,董強

1.上海市長寧區(qū)中心醫(yī)院神經內科,上海200336;2.復旦大學附屬華山醫(yī)院神經內科,上海200040

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是常見的多發(fā)生于中老年的退行性神經病變,其主要病理生理學特征是中腦黑質和紋狀體多巴胺能神經通路變性。多巴胺的合成減少,抑制乙酰膽堿的功能降低,乙酰膽堿的興奮作用相對增強,兩者的失衡引起一系列臨床癥狀。大多數(shù)原發(fā)性PD患者起病多＞60歲,約20%的病例起?。?0歲,極少數(shù)人可在兒童期或青春期發(fā)病。臨床上PD的典型表現(xiàn)為進行性運動徐緩、肌強直及震顫、姿勢反射障礙、腦脊液中多巴胺代謝產物高香草酸含量降低等[1]。

目前對于PD多主張早期采用神經保護劑治療,這對疾病的早期診斷提出了較高的要求。然而迄今為止PD的診斷仍主要依賴臨床表現(xiàn),診斷的準確性和特異性在很大程度上受到醫(yī)師臨床經驗的影響,這給亞臨床、疾病早期以及不典型PD患者的診斷帶來很大困難[2]。近十年來,隨著人類基因組計劃的實施和蛋白質組學的發(fā)展,分子生物學診斷正逐步被運用于退行性神經變性疾病中。對PD而言,篩查出能在疾病早期檢測到的、有特異性的標記物有利于提高亞臨床或臨床前期患者的確診率,對PD的積極預防、早期治療以及改善患者的生活質量和延長生命都有十分重要的意義。

早年研究曾提示編碼α-synuclein、Parkin、泛素羧基端水解酶 L1、DJ-1蛋白、PINK1、富含亮氨酸重復激酶2等基因的突變可能與PD的發(fā)生有關[3-8],同時也有研究提示載脂蛋白E2/E4的多態(tài)性可能和PD的易感性相關[9,10]。然而,后續(xù)研究并未能證實這些基因表達的異?；蚨鄳B(tài)性能運用于PD的早期診斷[11]。2007年,通過比較PD患者與對照組的外周血液樣本,Scherzer等[12]報道有22個基因的表達水平在PD患者中出現(xiàn)明顯變化,而其中又以大腸癌負相關基因ST13和B細胞淋巴瘤/白血病基因家族成員BCL11B表達的下調最為明顯。Scherzer等因此猜測這2個基因或許可以作為PD診斷的分子標記物。然而,先前的研究只局限于少數(shù)病例和對照組的比較,而且尚未對PD患者的病情進行分級,因此目前對這2種基因的表達在PD各階段中的變化規(guī)律尚不明確,也不清楚兩者是否有可能運用于PD的早期診斷。

為了進一步明確ST13和BCL11B基因在PD病程中的表達變化規(guī)律,也為探索它們在早期診斷PD中的應用價值,本研究收集各期PD患者和自愿健康對照者的外周血液樣本,比較兩者在各組間的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經由醫(yī)院倫理委員會批準,所有受試者均知情同意。選擇PD患者99例為PD組,男女比例為51∶48;平均年齡(57.5±6.8)歲。另選取健康志愿者20例為對照組,男女比例為1∶1;平均年齡(54.5±6.7)歲。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義,均接受全面的臨床檢查,包括:病史詢問、體格檢查、神經系統(tǒng)專科檢查、常規(guī)化驗、心電圖、胸部X線及腦部CT和/或MRI掃描。PD的臨床診斷參照美國國家神經疾病與中風學會制定的診斷標準[13]。PD組的臨床分級仍是采用Margaret Hoehn和Melvin Yahr于1967年制定的分級方法(Hoehn-Yahr分級)[14]:Ⅰ期,單側身體受影響,功能減退很小或沒有減退;Ⅱ期,身體雙側或中線受影響,但無平衡功能障礙;Ⅲ期,受損害的第1個癥狀是直立位反射,當轉動身體時出現(xiàn)明顯的站立不穩(wěn)或當兩腳并立,身體被推動時不能保持平衡,患者有某些工作能力的損害,但能完全過獨立生活;Ⅳ期,嚴重的無活動能力,但患者仍可自己走路和站立;Ⅴ期:除非得到幫助只能臥床或坐輪椅。排除伴有任何精神疾病或任何除PD之外的退行性神經病變的患者,任何患有神經變性疾病的患者,腦腫瘤、腦卒中患者,任何腦內炎性疾病以及系統(tǒng)性病變(如類風濕關節(jié)炎、糖尿病、高血壓等)患者。PD患者的治療主要依據(jù)第2版《中國帕金森病治療指南》(簡稱《指南》)[15]。對于尚未使用《指南》中涉及藥物或手術進行治療的PD患者,本研究將其視為未治療者,見表1。由于PD組24名Hoehn-Yahr I級患者癥狀輕微,且均未開始接受正規(guī)治療,在本研究中被視為原發(fā)性早期PD病例。

表1 PD組 Hoehn-Yahr分級

1.2 方法 所有的血液樣本于清晨7點在受試者空腹狀態(tài)下采集。血樣在進行分析前保存在4℃冰箱內,保存時間不超過2 h。采用QIAamp血液RNA試劑盒(Qiagen)提取外周血淋巴細胞RNA。并對每個樣本的RNA含量用分光光度計定量。提取每個樣本50 ng RNA,經Invitrogen Superscript III試劑盒合成相應的cDNA,并用 TaqMan實時定量PCR進行ST13和BCL11B檢測,檢測結果用管家基因RPLP0進行標化。ST13引物序列為5'-AAG CCC TAA ATG ATG GTG AAC TC-3'(正向)和 5'-GCT CTG TCA CAG TCT CGG A-3'(反向),產物大小154 bp;BCL11B引物序列為5'-TCA AAT GAA CTT CCC CTT GG-3'(正向)和5'-ACC TGC AAT GTT CTC CTG CT-3'(反向),產物大小247 bp;RPLP0引物序列為5'-GGC GAC CTG GAA GTC CAA CT-3'(正向)和 5'-CCA TCA GCA CCA CAG CCT TC-3'(反向),產物大小194 bp;betaactin引物序列為5'-GTC TTC CCC TCC ATC GTG-3'(正向)和5'-AGG TGT GGT GCC AGA TTT TC-3'(反向),產物大小181 bp。PCR反應條件為 94℃預變性300 s,94℃變性40 s,56℃退火50 s,72℃延伸30 s,其中變性、退火、延伸3者循環(huán) 40次,最后72℃延伸5 min。

1.3 統(tǒng)計學處理 SPSS 15.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以(±s)表示,t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實時熒光定量PCR比較對照組和各級PD患者外周血淋巴細胞中ST13和BCL11B的表達水平,見圖1。PD組Hoehn-YahrⅡ-Ⅴ級的患者外周血的ST13表達水平分別為對照組的(0.51±0.29)倍、(0.43±0.22)倍、(0.47±0.14)倍和(0.43±0.16)倍,均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。Hoehn-YahrⅠ級患者的ST13表達水平為對照組的(0.81±0.31)倍,無統(tǒng)計學差異,見圖 2a。PD組Hoehn-YahrⅡ-Ⅴ級患者外周血中BCL11B的表達量分別為對照組的(0.59±0.26)倍、(0.69±0.31)倍、(0.60±0.24)倍和(0.64±0.28)倍,均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。與ST13不同,Hoehn-YahrI級患者的BCL11B表達水平為對照組的(0.61±0.32)倍,也有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),見圖2b。另外,由于25例Hoehn-YahrⅡ級患者中有16例(64%)未接受過《指南》[15]中所涉及的藥物或手術治療,將其作為未接受治療亞組與其他83名已接受治療的患者進行了比較,統(tǒng)計結果顯示,ST13和BCL11B的表達水平在2亞組間無統(tǒng)計學差異,見圖2c。

3 討論

PD的亞臨床診斷非常困難,當患者出現(xiàn)首發(fā)癥狀時,其腦內的病理改變已非常顯著。據(jù)統(tǒng)計,PD首診患者黑質致密部多巴胺能神經元平均已喪失約60%～80%,而殼核的多巴胺水平也較正常人下降約80%[1,16]。如果能找到PD的特異性標志物,那么就可以在較大人群范圍內對PD進行篩查,及早發(fā)現(xiàn)亞臨床和臨床早期PD患者,及時進行治療,達到推遲或避免臨床癥狀惡化的目的。本研究展示了外周血ST13和BCL11B基因表達的變化與臨床各期PD的關系,并探討了它們在診斷早期PD患者中的應用價值。

ST13基因是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種與大腸癌發(fā)病有負性相關的基因,其序列與伴侶分子p48完全相同,故被認為是同一蛋白。ST13/p48還被稱為Hip或熱休克蛋白結合蛋白。ST13基因定位于人染色體22q13,cDNA全長3145 bp。BCL11包括BCL11A和BCL11B基因,是 B細胞淋巴瘤/白血病(B-cell lymphoma/leukemia,BCL)家族的新成員。該家族蛋白在細胞的增殖和抗凋亡等方面起重要作用。BCL11B編碼一種鋅指蛋白,該基因的轉位和表達異常可能與淋巴細胞惡性轉化有一定的關系,但目前對BCL11B的具體功能還不是非常清楚。2007年,Scherzer等[12]比較健康對照者和PD患者的周圍血樣,發(fā)現(xiàn)有22個基因的表達在PD患者中明顯下調,其中又以 ST13和BCL11B最為顯著,因此推測檢測這2種基因的表達可能有助于PD的診斷。本研究發(fā)現(xiàn),雖然在較高級別的 PD患者中ST13和BCL11B的表達均有明顯下調,但在Hoehn-YahrⅠ級患者中只有BCL11B的表達水平與健康對照組有明顯不同,而ST13表達至少要在Hoehn-YahrⅡ級患者中才出現(xiàn)明顯異常。因此,如果兩個基因確證能應用于PD診斷,那么就早期診斷的敏感性而言,BCL11B更具有優(yōu)越性。

然而,如果要將ST13、BCL11B、或者其他潛在的PD分子標記物運用于臨床診斷,一個必需闡明的問題是這些標記物是否具有特異性。也就是說,這些標記物的出現(xiàn)、消失、上升、或下調是否只有在PD患者中才出現(xiàn)。就目前的研究結果來看,要找到PD特異的標記物還非常困難。許多潛在的PD分子標記物(如載脂蛋白E等)在其他退行性神經病變中也可能出現(xiàn)較明顯的變化。但是,如果將幾個標記物進行聯(lián)合檢測,理論上應該可以提高診斷的特異性,這可能是今后一段時間內PD分子診斷的研究方向。

PD患者的外周血 ST13和BCL11B表達水平均較健康對照組有明顯下降,是潛在的可作為PD分子診斷的標志物。BCL11B的表達在Hoehn-YahrⅠ級的早期PD患者中就明顯下降,而ST13要在Hoehn-YahrⅡ級以上患者中才表現(xiàn)出差異。因此,就敏感性而言,BCL11B優(yōu)于ST13。

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