張燕青，武云霞

（山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院口腔科，山西太原 030001）

牙周炎可導(dǎo)致牙周支持組織炎癥及牙周袋形成，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)行性附著表失，牙槽骨吸收，最后可導(dǎo)致牙松動、脫落。牙周炎的最終治療目的是使被吸收的牙槽骨重建，牙周袋消失，使具有新附著能力的牙周膜細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)占領(lǐng)根面，從而在原已暴露于牙周袋內(nèi)的根面上形成新的牙骨質(zhì)，并有牙周膜纖維埋入，形成新附著[1]。牙周組織再生重建的關(guān)鍵是牙周膜細(xì)胞的增殖與分化。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming factorβ1，TGF-β1）在機(jī)體內(nèi)有多種調(diào)節(jié)功能[2-6]，對牙周組織再生修復(fù)有重要影響，通過刺激牙周膜細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)牙周軟組織的再生和牙周硬組織的形成，在牙周組織損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。TGF-β1作為重要的生物活性因子，具有廣闊的應(yīng)用前景。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）廣泛分布于全身器官，不但在牙齒發(fā)育和損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，而且對人牙髓和牙周膜的增殖和分化中也有重大作用[2]。本實(shí)驗(yàn)觀察TGF-β1和NGF對體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞（periodontal ligamentcell，PDLC）的單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用的作用，為TGF-β1和NGF聯(lián)合應(yīng)用于牙周損傷后修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

TGF-β1（Cytokine，美國）；NGF（Cytokine，美國）；低糖 DMEM培養(yǎng)液，胰蛋白酶（Sigma，美國）；胎牛血清（FBS，浙江金華清湖犢牛利用研究所），用時加入100 mg/L鏈霉素和106 U/L青霉素；人牙周膜細(xì)胞（hPDLCs，山西口腔醫(yī)院）；噻唑鹽（MTT，Sigma，美國）；二甲基亞砜（DMSO，西安化學(xué)試劑廠）。 自動CO2孵箱（美國Forma Scientific公司）；DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀（華東電子管廠）；UV-265FW型紫外可見分光光度計（日本Shimadzu公司）。

1.2 PDLC的傳代培養(yǎng)和來源鑒定

將儲存于液氮中的PDLC取出后立即放在37℃水浴箱中加熱，不時搖動，使其急速融化，30 s～1 min后，等到完全溶解后移入離心管低速離心后，移入25 ml培養(yǎng)瓶中，加入5～8 ml含10%小牛血清的雙抗DMEM培養(yǎng)液，混合均勻后移入溫度為37℃、壓力為950 ml/L且含5%CO2的恒溫空氣的標(biāo)準(zhǔn)孵箱中孵育，當(dāng)培養(yǎng)液由紅轉(zhuǎn)黃后換液，直至細(xì)胞長滿瓶底80%左右時，用25%的胰蛋白酶消化，在倒置顯微鏡下觀察PDLC的生長狀態(tài)、細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞形態(tài)變化。顯微鏡下見大部分PDLC突起收縮，細(xì)胞變圓時，迅速用含10%FBS的DMEM終止消化，輕輕吹打后，移入離心管低速離心后分裝為2瓶，等傳代到第6代時，利用免疫組化法進(jìn)行細(xì)胞來源鑒定，波形絲蛋白染色陽性，細(xì)胞角蛋白染色陰性。

1.3 TGF-β1和NGF對人PDLC增殖生物學(xué)作用的濃度效應(yīng)比較

取生長良好的第6代人PDLC，胰酶消化，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×104/ml，接種于 96 孔板，每孔 200 μl，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，加入含10%FBS的雙抗DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液和未貼壁的細(xì)胞，換用含無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞相對同步化。對照組用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組采用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，加入不同濃度的 TGF-β1，終濃度為 0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 ng/ml；加入不同濃度的 NGF，終濃度為 0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 ng/ml，每濃度組 4 孔，于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境的孵箱中培養(yǎng)3 d后，每孔加入MTT 20μl，培養(yǎng)4 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜，于振蕩儀上充分振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長下測定各孔的A值，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

1.4 TGF-β1和NGF聯(lián)合作用對人PDLC增殖的生物學(xué)作用

把已經(jīng)測得最佳效應(yīng)濃度的TGF-β1、NGF和TGF-β1+NGF按照上述方法加入96孔板，細(xì)胞濃度同“1.3”，每孔液量為200μl，加因子后第3天用MTT法檢測細(xì)胞增殖，測定A值，進(jìn)行組間及對照組比較。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用 SPSS 11.0進(jìn)行分析，不同濃度的TGF-β1與NGF及兩者的聯(lián)用效果對人PDLC增殖的生物學(xué)作用的比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對人PDLC增殖的生物學(xué)作用的濃度效應(yīng)

見表 1。

表1 不同濃度的TGF-β1對人PDLC增殖的生物學(xué)作用（x±s）

與對照組比較，#P＜0.05，△P＜0.01

與對照組比較，濃度為 0.1～100.0 ng/ml的TGF-β1單獨(dú)應(yīng)用均具有促進(jìn)人PDLC增殖的生物學(xué)作用，但是促進(jìn)增殖的效果不同，其中濃度為10 ng/ml的TGF-β1為最佳效應(yīng)濃度。

2.2 NGF對人PDLC增殖的生物學(xué)作用的濃度效應(yīng)

見表2。

表2 不同濃度的NGF對人PDLC增殖的生物學(xué)作用（x±s）

與對照組比較，濃度為1.0、10.0、100.0μg/ml的NGF單獨(dú)應(yīng)用具有促進(jìn)人PDLC增殖的生物學(xué)作用，其中濃度為10.0μg/ml的NGF為最佳效應(yīng)濃度。

2.2 TGF-β1和NGF聯(lián)合應(yīng)用對人PDLC增殖的生物學(xué)作用

最佳TGF-β1濃度與最佳NGF濃度以及兩者聯(lián)用時對人PDLC增殖的生物學(xué)作用見表3。兩者聯(lián)合應(yīng)用所測得的A 值為（0.602±0.004），TGF-β1單獨(dú)應(yīng)用時所測得的 A 值為（0.522±0.060），NGF 單獨(dú)應(yīng)用測得的 A 值為（0.304±0.020），比其他兩組高，說明聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。3討論

表3 TGF-β1、NGF聯(lián)合應(yīng)用對人PDLC增殖的生物學(xué)作用（x±s）

PDLC是一類具有各種不同功能和分化潛力的細(xì)胞[3]，是牙周組織再生修復(fù)的主要細(xì)胞群，其生物學(xué)特征包括：合成和分泌大量的膠原和非膠原蛋白，表達(dá)較高的ALPase活性[4-6]?，F(xiàn)今牙周病治療研究的主要問題是如何促進(jìn)牙周膜來源的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為新的牙糟骨、牙周膜及牙骨質(zhì)，恢復(fù)牙周組織原有的結(jié)構(gòu)和功能。TGF-β1是一種多肽調(diào)節(jié)因子，能調(diào)節(jié)起源于間充質(zhì)細(xì)胞，特別是成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖功能，是組織損傷修復(fù)的主要調(diào)節(jié)因子[7-9]。NGF不僅對神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育、分化、再生發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，還參與調(diào)控牙齒的發(fā)育和損傷后的痛覺過敏及修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的NGF可顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞DNA合成，刺激DNA合成前期的細(xì)胞向DNA合成期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)體外培養(yǎng)的人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞增殖。研究證實(shí)，NGF可顯著促進(jìn)人牙髓細(xì)胞及牙周膜細(xì)胞的增殖。Oates等[10]研究認(rèn)為，生長因子的聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞的增殖效應(yīng)高于一種因子本身的作用，故TGF-β1和NGF的聯(lián)合應(yīng)用效應(yīng)顯著高于單獨(dú)應(yīng)用。本研究采用MTT比色法觀察不同濃度的TGF-β1和NGF對PDLC的增殖作用，MTT被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原為不溶于水的藍(lán)紫色物質(zhì)，在二甲基亞砜的溶解下成藍(lán)紫色液體，再用酶標(biāo)儀測定A值，反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量。MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，可重復(fù)性好，是目前被廣泛采用的檢測細(xì)胞增殖的方法[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10.0 ng/ml TGF-β1和 10.0 μg/ml NGF聯(lián)用可顯著促進(jìn)PDLC的增殖，具有協(xié)同作用。

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