楊春寶,丁江華,鄭章清

染料木黃酮(genistein),又名 5,7,4-三羥基異黃酮,可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。脂質(zhì)體作為一種新型藥物載體,可有效降低毒副作用,且免疫脂質(zhì)體可將藥物靶向釋放到靶分子。本研究制備了染料木黃酮脂質(zhì)體(GL),并以肺腺癌細(xì)胞株 A549細(xì)胞、肝癌細(xì)胞株 HepG2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,考察 GL對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters 600型高效液相色譜系統(tǒng);DiamonsilTMC18ODS分析柱;BIO-RAD 680型酶標(biāo)儀;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;LA-950型激光粒度分析儀;VORTEX21K高速冷凍離心機(jī)。染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品;MEM培養(yǎng)基;胎牛血清(FBS);非必需氨基酸;胰蛋白酶;乙二胺四乙酸;膽固醇;大豆卵磷脂;甲醇;四甲基偶氮唑藍(lán);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549肺腺癌細(xì)胞株和 HepG2肝癌細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所(ATCC number分別為 CCL-185和 HB-8065TM)。分別常規(guī)培養(yǎng)于含 10%FBS的 RPMI-1640培養(yǎng)基和改良MEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：5%CO2、濕度 95%、37℃。每周傳代 2次。待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿后,棄去舊培養(yǎng)基,以適量 2.5 g/L胰蛋白酶和 0.2 g/L乙二胺四乙酸(體積比為 1∶1)混合液將細(xì)胞消化約 1 min,棄去消化液并加入適量含 10%FBS的 MEM培養(yǎng)基,反復(fù)吹打后制備細(xì)胞懸液,以 1∶4的比例傳代。

1.3 染料木黃酮脂質(zhì)體(GL)的制備方法 超聲薄膜法制備 GL[1]。

1.4 GL對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 分別將 A549細(xì)胞和 HepG2細(xì)胞接種于 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔20 000個(gè)細(xì)胞。過(guò)夜貼壁后,實(shí)驗(yàn)組加入 GL(終濃度分別為 5、20、50μmol/L),對(duì)照組補(bǔ)加等體積的培養(yǎng)基,分別于第 24、48、72、96 h取樣,臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞拒染法計(jì)算各組活細(xì)胞數(shù),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。于 96孔板中采用常規(guī) MTT方法(作用 48 h),分別測(cè)定染料木黃酮及 GL對(duì) A549和 HepG2細(xì)胞的體外增殖抑制作用,并計(jì)算 IC50。

2 結(jié) 果

2.1 GL粒度分布 將 GL適當(dāng)稀釋后在激光粒度分析儀上進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,脂質(zhì)體平均粒徑為136.7 nm,粒徑分布范圍窄,基本符合正態(tài)分布規(guī)律。

2.2 GL對(duì) A 549和 HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 GL作用較長(zhǎng)時(shí)間后,細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制,且呈劑量依賴性。作用 24 h后,20μmol/L GL對(duì) A 549和HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別達(dá) 37%和 35%,50 μmol/LGL處理時(shí)生長(zhǎng)抑制率可達(dá) 55%和 57%。結(jié)果見圖 1。

圖1 不同濃度 GL處理時(shí) A549細(xì)胞(A)和 HepG2細(xì)胞(B)的生長(zhǎng)曲線

2.3 染料木黃酮及 GL對(duì) A549和 HepG2細(xì)胞的體外增殖抑制作用 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,染料木黃酮和 GL均呈劑量依賴性抑制 A549和 HepG2細(xì)胞的體外增殖;且 GL對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于游離染料木黃酮。GL對(duì) A549和 HepG2細(xì)胞的 IC50分別為 10.46、12.34μmol/L,而游離染料木黃酮對(duì) A549和 HepG2細(xì)胞的 IC50分別為 32.35、30.87μmol/L。結(jié)果見圖 2。

圖2 不同濃度 GL和游離染料木黃酮對(duì) A549細(xì)胞(A)和 HepG2細(xì)胞(B)增殖作用的影響(n=3)

3 討 論

目前認(rèn)為染料木黃酮具有抗腫瘤作用機(jī)制有：①染料木黃酮可與雌激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合雌激素受體,從而減輕雌激素的促細(xì)胞增殖作用,降低與雌激素有關(guān)的腫瘤發(fā)病危險(xiǎn)性[2];②染料木黃酮是酪氨酸蛋白激酶(PTK)的強(qiáng)抑制劑,對(duì) PTK的抑制作用是其抗癌效應(yīng)的重要分子機(jī)制[2];③染料木黃酮可抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性,引起腫瘤細(xì)胞的 G2/M期阻滯,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3];④還可誘導(dǎo)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因表達(dá)上調(diào)[4]。染料木黃酮是一種很有潛力的腫瘤化療藥物,具有廣泛的應(yīng)用前景,但其難溶于水,且具生殖內(nèi)分泌毒性[5]、免疫毒性[6]、神經(jīng)毒性[7]及遺傳毒性[8]等多種毒副作用,限制了該化合物的進(jìn)一步開發(fā)利用。

本研究制備了染料木黃酮脂質(zhì)體,并對(duì)該制劑的穩(wěn)定性及對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用進(jìn)行了觀察,為將該化合物制備成免疫脂質(zhì)體提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,染料木黃酮脂質(zhì)體對(duì) A 549和 HepG2細(xì)胞的體外增殖抑制作用明顯強(qiáng)于游離染料木黃酮,其 IC50大約是游離藥物的1/3。其機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞攝取脂質(zhì)體中藥物的方式有關(guān)。脂質(zhì)體主要通過(guò)細(xì)胞膜融合作用而被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞,因而腫瘤細(xì)胞能有效攝取脂質(zhì)體中藥物,與游離藥物進(jìn)入細(xì)胞的方式相比,該方式能使腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物攝取量增加許多倍。

為進(jìn)行染料木黃酮脂質(zhì)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用研究,本研究中首先將制備的染料木黃酮脂質(zhì)體用 0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾,不可避免的造成了藥物的損失。分析認(rèn)為,可能與粒徑較大的脂質(zhì)體顆粒所能包裹的藥物分子較多有關(guān)。需進(jìn)一步改善脂質(zhì)體的制備工藝,以減少粒徑較大的脂質(zhì)體的比例及因此造成的藥物損失。

[1]蔣天智,劉少友.新型長(zhǎng)循環(huán)紫杉醇脂質(zhì)體的制備及其細(xì)胞毒性[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2007,11(26)：5113-5116.

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