史 躍,王安明,陳啟忠,朱麗麗,劉軍權(quán),丁 凱,高從敬

近年來,干細胞的移植和組織工程是最引人關(guān)注的課題,自體骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)移植在骨壞死的治療領(lǐng)域中得到應(yīng)用。我科采用動脈溶栓聯(lián)合自體灌注介入治療股骨頭缺血性壞死 30例,取得了滿意的療效,報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2006年 1月至 2008年 12月,采用動脈溶栓聯(lián)合自體 MSC治療股骨頭缺血性壞死患者 30例(觀察組)。其中 16例有外傷史,28例有飲酒史,無大量應(yīng)用激素。單側(cè) 21例,雙側(cè) 9例。男24例,女 6例。年齡 26～48歲,平均 36.5歲。病史3個月 ～1年。并與同期單純采用介入導(dǎo)向動脈溶栓 34例(對照組)作比較。全部病例均有治療前、后血管造影片及 CT、MRI片,診斷明確。Ficat和Arlet分期[1]：觀察組Ⅰ期 2例,Ⅱ期 18例,Ⅲ期 7例,Ⅳ期 3例;對照組Ⅰ期 1例,Ⅱ期 16例,Ⅲ期 11例,Ⅳ期 6例。兩組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),有可比性。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)方法 抽取患者骨髓20 ml,肝素抗凝,用人 MSC分離液分離單個核細胞,吸取單個核細胞,用 pH7.4 PBS洗 3次,將細胞懸浮于 15%胎牛血清 DMEM F12培養(yǎng)基中,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后棄懸浮細胞繼續(xù)用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁細胞,細胞生長至底面積的 70%時用乙二酸四乙氨二鈉(EDTA)胰酶消化貼壁細胞后傳代培養(yǎng)。標(biāo)本從采集到分離時間不超過1 h。顯微鏡下每天觀察細胞生長及增殖情況。分別取各代 MSC,置于有小玻片的 6孔板中,待細胞80%～90%貼壁生長后取出,用 10%中性甲醛固定,蘇木精染色,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。經(jīng) 3～5代培養(yǎng)后 MSC即可達到治療數(shù)量。細胞培養(yǎng)板更換含有 10-7mmoL/L地塞米松、10 mmol/Lβ-磷酸甘油、0.05mmol/L維生素 C和 15%胎牛血清的成骨分化誘導(dǎo)液,培養(yǎng) 3周,每周換液 2次,分別于誘導(dǎo)的第 7、14天取出部分細胞固定,觀察細胞形態(tài)學(xué)變化并進行組織學(xué)染色。收集體外向成骨細胞誘導(dǎo)第 14天的 MSC制備成 20ml細胞懸液供患者治療使用,MSC數(shù)量約為 1×107～1×108個。

1.3 主要觀察指標(biāo)[2]①臨床指標(biāo)：干細胞移植后隨訪觀察患者髖關(guān)節(jié)疼痛程度、疼痛性質(zhì)及疼痛時間變化、行走距離及步態(tài)變化、髖關(guān)節(jié)外展與內(nèi)旋功能變化。②數(shù)字減影血管造影術(shù)(DSA)及 X線攝片檢查指標(biāo)：干細胞移植后 6個月行股骨頭供血動脈造影術(shù),觀察血管新生及股骨頭供血動脈充盈情況;每 6個月行髖關(guān)節(jié) X線片檢查,觀察股骨頭區(qū)骨質(zhì)變化。

1.4 關(guān)節(jié)活動度參照標(biāo)準(zhǔn)[3]0級：髖關(guān)節(jié)屈伸、外展、內(nèi)收、外旋、內(nèi)旋度數(shù)總和為 260°～320°為正常;1級：髖關(guān)節(jié)屈伸、外展、內(nèi)收、外旋、內(nèi)旋度數(shù)總和為 259°～190°,功能稍受限,生活基本自理;2級：為 189°～ 160°,功能部分受限;3級 ：為 159°～130°,功能明顯受限;4級：為﹤130°,功能嚴(yán)重受限。

1.5 治療方法 常規(guī)下采用 seldinger技術(shù),經(jīng)皮-股動脈穿刺,用 COOK或 Cordis 5.0 FCobra導(dǎo)管常規(guī)行患側(cè)股動脈、髂內(nèi)動脈 DSA。以 6ml/s注射速度,6幀/s連續(xù)采集圖像,連續(xù)采集 20 s,根據(jù) DSA表現(xiàn),了解旋股內(nèi)、外動脈、閉孔動脈的起源及股骨頭血供。觀察組將 5.0 F Cobra導(dǎo)管選擇至患側(cè)旋股內(nèi)動脈、旋股外動脈或閉孔動脈,灌注脲激酶 40萬 U,罌栗鹼 30 mg。然后經(jīng) 5.0 F導(dǎo)管送入 3.0 F微導(dǎo)管,超選擇至旋股內(nèi)動脈股骨頭供養(yǎng)血管分支,經(jīng)微導(dǎo)管緩慢灌注 MSC懸液,術(shù)后靜脈滴注低分子右旋糖酐 500m l,連續(xù) 5天。對照組將 5.0 F Cobra導(dǎo)管選擇至患側(cè)旋股內(nèi)動脈、旋股外動脈或閉孔動脈,直接灌注脲激酶 40萬 U,罌栗鹼 30mg。兩組間隔 2、4周再進行第 2、3次介入治療,3次為一療程。觀察股骨頭血管數(shù)量及粗細變化、血管密度改變及股骨頭造影染色情況。囑患者臥床或患肢避免負重2～3個月,在此期間服用鈣劑、活血類藥物改善微循環(huán),同時進行功能鍛煉。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 樣本數(shù)據(jù)組間比較采用 χ2檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DSA表現(xiàn) 本組 64例股骨頭區(qū)血供主要由旋股內(nèi)動脈、旋股外動脈的分支供養(yǎng)(圖 1A)。38例表現(xiàn)為缺血型,觀察組 18例,對照組 20例,DSA主要表現(xiàn)為股骨頭分支血管稀、細、少或呈落葉后的柳樹枝狀(圖 1B);17例表現(xiàn)為淤血型,觀察組 8例,對照組 9例,主要為股骨頭區(qū)呈團狀血管增多,靜脈期呈湖狀改變(圖 1C);9例表現(xiàn)為混合型,觀察組 4例,對照組 5例,主要表現(xiàn)為血管阻塞、缺血和淤血同時存在(圖 1D)。經(jīng)過溶栓、擴張血管,動脈灌注體外向成骨細胞誘導(dǎo)第 14天的 MSC懸液 20 ml,治療 1個療程后,對比同一時相 DSA圖像,股骨頭頸區(qū)域血管數(shù)量及粗細變化。觀察組 29例表現(xiàn)為狹窄閉塞血管再通或明顯出現(xiàn)側(cè)支循環(huán)血管,同區(qū)域血管明顯增多、增粗并延長,靜脈回流通暢,股骨頭血管染色區(qū)域明顯增大(圖 1E)。

2.2 關(guān)節(jié)活動度 見表 1。觀察組治療前、后關(guān)節(jié)活動度比較有顯著性差異(P＜0.01),觀察組與對照組治療后關(guān)節(jié)活動度的比較無差異(P＞0.05)。

表1 兩組治療前、后關(guān)節(jié)活動度的比較(例)

2.3 骨質(zhì)變化的影像學(xué)表現(xiàn) 治療 1個療程后,經(jīng)6～18個月的隨訪觀察。早期(3～6個月)骨囊變區(qū)骨質(zhì)增生硬化不明顯,后期(6～18個月)骨囊變區(qū)縮小,骨質(zhì)增生硬化明顯,股骨頭壞死區(qū)域逐漸縮小。觀察組為 29例,有效率為 96.7%(29/30);對照組為 29例,有效率為 85.3%(29/34)。

2.4 髖部疼痛 治療 1個療程后,觀察組疼痛消失22例,明顯減輕 4例,輕度減輕 3例,無變化 1例,有效率為 96.7%(29/30);對照組疼痛消失 19例,明顯減輕 8例,輕度減輕 3例,無變化 4例,有效率為88.2%(30/34)。

圖1 股骨頭缺血性壞死數(shù)字減影血管造影表現(xiàn)

3 討 論

3.1 MSC治療股骨頭缺血性壞死的臨床意義 股骨頭缺血性壞死的發(fā)病可能與成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞的功能下降有關(guān)[4]。多項實驗及臨床研究證實骨髓干細胞體外分離培養(yǎng)后,在一定誘導(dǎo)條件下,可以向血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞及成骨細胞方向分化[5]。我們采用介入法在溶栓的基礎(chǔ)上,經(jīng)旋股內(nèi)動脈灌注 MSC懸液,通過對股骨頭缺血性壞死30例 3個療程的治療,發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死區(qū)表現(xiàn)為狹窄閉塞血管再通或明顯出現(xiàn)側(cè)支循環(huán)血管,同區(qū)域血管明顯增多、增粗并延長,靜脈回流通暢,股骨頭血管染色區(qū)域明顯增大;壞死股骨頭囊變區(qū)縮小,骨質(zhì)增生硬化明顯,股骨頭壞死區(qū)域逐漸縮小。

3.2 MSC治療股骨頭缺血性壞死的前景 隨著干細胞工程技術(shù)的興起和發(fā)展,干細胞治療股骨頭缺血性壞死成為研究熱點。特別是對 MSC研究的不斷深入,股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機理有了新的認識,治療方法也有了新的進展,給股骨頭缺血性壞死帶來了新的希望。Hernigou等[6]和 Ganji等[7]分別使用自體骨髓細胞修復(fù)股骨頭壞死病灶清除后的缺損,均取得良好療效。楊曉鳳等[2]使用外周血及骨髓干細胞移植治療缺血性疾病,證實干細胞形成新生血管直接改善血供?？梢娡ㄟ^骨髓干細胞動脈灌注治療股骨頭缺血性壞死,既有利于股骨頭血液供應(yīng)的恢復(fù),又能提高局部成骨能力,從而促進壞死骨的修復(fù),對早期股骨頭壞死的治療是有利的,目前多與其他療法合并應(yīng)用[8]。

[1]趙德偉.股骨頭缺血壞死的修復(fù)與再造[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1998：19-48.

[2]楊曉鳳,王紅梅,許憶峰,等.經(jīng)動脈骨髓干細胞移植治療股骨頭壞死 63例[J].中國臨床康復(fù),2006,10(13)：3-5.

[3]張孟增,劉滄君,路志福,等.骨髓內(nèi)減壓與加壓注藥在成人股骨頭壞死中的應(yīng)用[J].實用放射學(xué)雜志,2001,17(5)：369-371.

[4]Gangji V,Hauzeur JP,Schoutens A,et al.Abnormalities in the replicative capacity of osteoblasitic cells in the proximal femur of patients with osteonecrosis of the femoral head[J].JRheumatol,2003,30(2)：348-351.

[5]Xu WR,Qian H,Zhu W,et al.Anorel tumor cell line cloned from mutated human embryonic bone morrow mesenchymal stem cells[J].Oncology Reports,2004,12(3)：501-508.

[6]Hernigou P,Beaujean F.Treatment of osteonecrosis with autologous bone marrow grafting[J].Clin Orthop,2002,405(1)：14-23.

[7]Ganji V,Hauzeur JP,Matos C.Treatment of osteonecrsis of the femoral head with implantation of autologousbonemarrow cells[J].Bone JointSurg Am,2004,86(6)：1153-1160.

[8]Mont MA,Jones LC,Hungerford DS.Nontraumatic osteonecrosis of the femoral head：ten years later[J].JBone Joint Surg Am,2006,88(5)：1117-1132.