王達(dá)理,樓建英,張 偉,韓 燕,陳金安

回顧近十年文獻(xiàn),維拉帕米(verapamil,Ver)細(xì)胞保護作用和細(xì)胞毒性作用一直受到關(guān)注,一方面有研究證實它可減輕缺血心肌再灌注損傷[1],另一方面又有報道它可增強抗腫瘤藥作用或直接殺傷癌細(xì)胞[2-4]。因此,Ver對心肌細(xì)胞具有保護的同時也可能存在毒性作用。本研究應(yīng)用培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,觀察連續(xù)培養(yǎng) 96 h和模擬“缺血再灌注”狀態(tài)下不同濃度Ver對細(xì)胞的影響;應(yīng)用活細(xì)胞代謝染色比色分析(MTT法)測定損傷細(xì)胞釋放酶活性,評估其細(xì)胞保護與細(xì)胞毒性作用及其與藥物濃度間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 出生 1周內(nèi)的 Wista大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供;小牛血清由第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院中心實驗室提供。維拉帕米注射液(芬蘭 Orion制藥廠生產(chǎn));用 Eagle(JRSUSA)干粉三蒸水配制培養(yǎng)基(MEM);胰蛋白酶 1∶250(Difco,USA);噻唑蘭(MTT,Sigma)用 PBS配成 2%溶液;LDH試劑盒(Beckman,USA);國產(chǎn)分析純試劑配制 Hang′s液和 PBS液。

1.2 心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法 Wista乳大鼠心肌剪成1.0mm ×1.0mm×1.0mm大小塊,用 0.1%胰蛋白酶消化成單個心肌細(xì)胞,經(jīng) Hang′s液清洗后再以含 20%小牛血清的 MEM充分混懸成每毫升含心肌細(xì)胞 1×106個,分別按 1m l、8 ml接種到 24孔板和培養(yǎng)瓶中靜置貼壁培養(yǎng),每 24 h更換 1次培養(yǎng)基,培養(yǎng) 72 h后分組處理。

1.3 心肌細(xì)胞的代謝測定 分組處理后用 Hank′s液清洗心肌細(xì)胞 2次,以培養(yǎng)基正常培養(yǎng) 4 h,再以Hank's液清洗心肌細(xì)胞 2次,棄培養(yǎng)基后 24孔板每孔加 200μl、25ml培養(yǎng)瓶每瓶加 1.6ml噻唑蘭溶液,37℃靜置 4 h,棄液后加二甲基亞酚每孔 600μl、每瓶 5.0ml,振蕩顯色后測 540 nm處的吸光度值(A540)。

1.4 心肌細(xì)胞的酶活性測定 測定 A 540前取細(xì)胞培養(yǎng)液在 Backman自動生化分析儀上測定乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)的活性。

1.5 細(xì)胞損傷與藥物保護作用

1.5.1 Ver對心肌細(xì)胞的毒性研究 培養(yǎng) 72h的心肌細(xì)胞 144孔分 6組,每組 24孔。正常培養(yǎng)組換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 96 h,藥物組分別用含有 Ver 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 96 h,每日觀察心肌細(xì)胞形態(tài)和搏動情況,最后測定乳酸脫氫酶和 A540。

1.5.2 Ver對模擬缺血再灌注損傷時心肌細(xì)胞的保護作用 將培養(yǎng) 72 h心肌細(xì)胞 72瓶分 6組,每組 12瓶。正常對照組換用無血清培養(yǎng)基,再灌注組及含 Ver 0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L組 (分別稱為 Ver A組、B組、C組、D組)換用氮氣預(yù)飽和無血清培養(yǎng)基后再以氮氣充滿培養(yǎng)瓶、旋緊瓶蓋培養(yǎng) 1 h,換入氧氣預(yù)飽和培養(yǎng)基正常培養(yǎng)4 h,留培養(yǎng)液測肌酸磷酸激酶活性;觀察心肌細(xì)胞形態(tài)和搏動情況,最后行活細(xì)胞代謝試驗測定比色值 A540。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 15.0統(tǒng)計軟件,建立數(shù)據(jù)庫并對心肌細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)的毒性研究中維拉帕米各濃度組與正常對照組數(shù)據(jù)比較用配對 t檢驗;對模擬“缺血再灌注”中各藥物濃度組和正常對照組、損傷對照組的數(shù)據(jù)比較用方差分析。對活細(xì)胞 MTT法比色值與損傷細(xì)胞釋放的心肌酶活性作相關(guān)性分析;P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ver對心肌細(xì)胞的毒性

2.1.1 Ver對心肌細(xì)胞搏動及形態(tài)的影響 在噻唑蘭代謝試驗前觀察細(xì)胞搏動,正常培養(yǎng)組的心肌細(xì)胞形成合胞體成片、快速(110～140次/分)、規(guī)律搏動,而未加藥物的缺氧復(fù)氧對照組的心肌細(xì)胞搏動快慢不等且不規(guī)律,部分培養(yǎng)瓶內(nèi)心肌細(xì)胞分割成多片搏動;維拉帕米組共 48瓶心肌細(xì)胞基本維持合胞體成片搏動,較高濃度組的搏動頻率緩慢(40～ 80次 /分)。

觀察心肌細(xì)胞形態(tài)時發(fā)現(xiàn) Ver 20.0mg/L以下濃度組的形態(tài)與正常培養(yǎng)組相近,Ver 50.0組有成片脫落現(xiàn)象。連續(xù)培養(yǎng)到 96 h,正常培養(yǎng)組的 24孔心肌細(xì)胞多數(shù)停止搏動;但是,Ver 1.0組全部 24孔心肌細(xì)胞都維持緩慢、成片搏動,即便是 Ver 50.0組仍觀察到多數(shù)培養(yǎng)孔內(nèi)心肌細(xì)胞存有散在肌束搏動,噻唑蘭代謝試驗前,正常培養(yǎng)組全部恢復(fù)正常搏動。

2.1.2 Ver對心肌細(xì)胞的活性影響 維拉帕米對心肌細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng) 96 h的毒性作用研究中,測得的乳酸脫氫酶活性與存活細(xì)胞代謝噻唑蘭比色值及其比較如表 1所示。各培養(yǎng)孔乳酸脫氫酶活性與 A540呈直線相關(guān),r=-0.989(P＜0.01)。

表1 不同濃度的維拉帕米對心肌細(xì)胞的乳酸脫氫酶活性與 A540的影響(±s,n=24)

表1 不同濃度的維拉帕米對心肌細(xì)胞的乳酸脫氫酶活性與 A540的影響(±s,n=24)

注：與正常培養(yǎng)組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

組 別 LDH(U/L) A540正常培養(yǎng)組 95.50±11.60 0.88±0.09 Ver 1.0 86.38±13.09* 0.94±0.10*Ver 5.0 101.48±11.99 0.84±0.10 Ver 10.0 107.50±20.45* 0.79±0.10**Ver 20.0 150.13±18.53** 0.63±0.09**Ver 50.0 337.29±43.88** 0.14±0.09**

2.2 Ver對缺血再灌注損傷時心肌細(xì)胞的保護作用 模擬缺血再灌注損傷各組,所測肌酸磷酸激酶活性與存活細(xì)胞代謝噻唑蘭的比色值及其組間數(shù)據(jù)比較結(jié)果如表 2所示。各培養(yǎng)瓶肌酸磷酸激酶的活性與 A540呈直線相關(guān),r=-0.986(P＜0.01)。

表2 在心肌細(xì)胞模擬缺血再灌注損傷時維拉帕米對肌酸磷酸激酶活性與A540的影響(±s,n=12)

表2 在心肌細(xì)胞模擬缺血再灌注損傷時維拉帕米對肌酸磷酸激酶活性與A540的影響(±s,n=12)

注：與正常培養(yǎng)組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與Ver B組比較,##P＜0.01;與缺血再灌注對照組比較,△△P＜0.01

組別 CK(U/L) A540正常培養(yǎng)組 18.50±2.36△△ 0.95±0.10△△對照組 32.83±7.99** 0.45±0.09**Ver A組 23.25±5.97##*△△ 0.72±0.17##*△△Ver B組 19.25±3.57△△ 0.94±0.07△△Ver C組 19.67±5.77△△ 0.94±0.10△△Ver D組 24.08±6.32△△*## 0.74±0.15△△**##

3 討 論

維拉帕米是鈣通道阻滯劑,缺血再灌注損傷時存在鈣負(fù)荷增加,含 Ver 150μg/kg的停搏液使心臟迅速停跳,鈣蓄積降低,復(fù)跳后心功能接近正常[1]。用 0.3mg/L Ver預(yù)處理的狗心臟在缺血再灌注時線粒體谷胱苷肽及磷脂的改變明顯減輕[5]。本實驗研究發(fā)現(xiàn) 1.0、2.0mg/L Ver對心肌細(xì)胞沒有明顯毒性,對心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷有明顯保護作用。然而,Ver 5.0mg/L對連續(xù)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞雖然未見有不良影響,但是 0.5mg/L Ver組心肌細(xì)胞在合并有缺氧再復(fù)氧時盡管相比損傷組顯示保護作用,但相比無缺氧再復(fù)氧損傷因素的正常培養(yǎng)組卻有明顯受損。這提示較低濃度時的保護作用有限,較高濃度時同樣達(dá)不到理想的結(jié)果,提示與其細(xì)胞毒性有關(guān)。

在連續(xù)培養(yǎng)時觀察到 Ver 10.0 mg/L及更高濃度組心肌細(xì)胞明顯受損。本實驗僅觀察 Ver在不同濃度時對心肌細(xì)胞的作用,其具體的作用機制尚不能確定。不過,有報道[2-4]Ver可抑制細(xì)胞 DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成并直接殺傷細(xì)胞。然而,活體動物的毒性還與甲狀腺功能有關(guān),甲狀腺功能減退鼠的半數(shù)致死量差不多只有正常者的一半。對氯化鈣誘發(fā)的心律失常,以及有效的抗心律失常劑量都與甲狀腺功能有關(guān),甲狀腺功能減退時兩者的劑量都偏小[6];毒性還涉及糖代謝[7]。這些資料也提示其毒性作用途徑較為復(fù)雜。

噻唑蘭(MTT)為一淡黃色唑氮鹽,被活細(xì)胞攝入經(jīng)線粒體脫氫酶還原成紫色顆粒沉淀于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍,二甲基亞酚溶解這些紫色顆粒,因而染色的深淺可判斷細(xì)胞存活、增殖及代謝情況[8]。紫色顆粒形成的量與細(xì)胞存活數(shù)有關(guān),實驗中酶學(xué)檢測法研究結(jié)果與比色法結(jié)果相似,兩者間有良好的負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外,噻唑蘭活細(xì)胞染色比色值還與細(xì)胞的代謝能力有關(guān),保護心肌細(xì)胞時除了細(xì)胞存活以外,更重要的還要維持其正常功能。最近報道[9]心臟介入時,支架釋放后即刻于靶血管內(nèi)注入維拉帕米可顯著改善冠狀動脈灌注和心肌灌注水平。這說明維拉帕米對維持心肌細(xì)胞正常功能有著重要的價值。本實驗結(jié)果中有關(guān)心肌細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞搏動情況,既涉及細(xì)胞存活數(shù)量更反應(yīng)存活細(xì)胞的功能,雖然所觀察到的結(jié)果有著較為重要臨床意義,但是未作量化分析比較,這主要是考慮到主觀指標(biāo)的統(tǒng)計分析價值有限,因而僅作描述,這是本實驗的不足之處。對涉及心肌細(xì)胞代謝和搏動功能,尚待完善觀察指標(biāo)作深入研究。

總之,無論是外科臨床用作心臟停搏液的組成部分還是內(nèi)科臨床心臟介入時用作抗心律失常、改善心肌供血[1,9],參照本實驗的結(jié)果,Ver所能達(dá)到的藥物濃度均對心肌細(xì)胞沒有直接的毒性。

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