R-扁桃酸是制備多種手性藥物的重要中間體，如用于半合成青霉素和頭孢菌素等抗生素、血管擴(kuò)張劑、殺菌劑、鎮(zhèn)痙劑、減肥藥物、抗腫瘤藥物等的合成[1,2]。R-扁桃酸的國際市場需求逐年增長，市場潛力巨大[3]，加快R-扁桃酸的研究開發(fā)具有重要的意義。

目前，制備R-扁桃酸的方法有化學(xué)不對(duì)稱合成法、化學(xué)拆分法、色譜拆分法和生物制備法,其中，生物制備法包括：動(dòng)力學(xué)拆分法[4]、不對(duì)稱轉(zhuǎn)化法[5,6]、去消旋作用[7～10]、雙酶轉(zhuǎn)化[11]、微生物和酶耦合反應(yīng)[12]、雙微生物發(fā)酵[13]等。微生物去消旋作用制備手性扁桃酸理論產(chǎn)率達(dá)50%，已有報(bào)道Brevibacteriumsp.[8]、Alcaligenessp.[9]和Pseudomonassp.[7,10]等微生物可選擇性降解制備R-或S-扁桃酸。

作者在此以外消旋扁桃酸為唯一碳源篩選得到一株能夠高效選擇性降解S-扁桃酸制備R-扁桃酸的新型菌株銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，并對(duì)該菌發(fā)酵制備R-扁桃酸的條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

外消旋扁桃酸、苯乙酮酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；其余試劑均為國產(chǎn)色譜純或分析純。

UV-1800型分光光度計(jì)，日本Hitachi;LC-10VP型高效液相色譜儀，日本島津；WXG-4型旋光儀。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g·L-1)：外消旋扁桃酸 4，酵母浸粉 1，NH4Cl 1.6，K2HPO41，KH2PO41，NaCl 1，MgSO40.5， pH值7.0。

篩選培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母浸粉 1.5，NH4Cl 0.8，K2HPO41，KH2PO41，NaCl 1，MgSO40.5，外消旋扁桃酸 5，pH值7.0。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g·L-1)：扁桃酸 5，酵母浸粉 5，NH4Cl 1.6，K2HPO41，KH2PO41，NaCl 1，MgSO40.5，MnSO40.05，pH值7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：甘油 1，蛋白胨 3.5，酵母浸粉 3.5，NH4Cl 4，K2HPO41，KH2PO41，NaCl 1，MgSO40.5，ZnSO40.4，pH值7.5。

1.3 方法

1.3.1 篩選

富集：各取1.5 g采自校園周圍的10個(gè)土樣置于以外消旋扁桃酸為唯一碳源的富集培養(yǎng)基中，于37℃、150 r·min-1富集培養(yǎng)48 h。

初篩：將富集培養(yǎng)液以2%的接種量，重新轉(zhuǎn)接于篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)液進(jìn)行系列稀釋涂布平板。在各個(gè)平板上挑出具有不同形態(tài)的單菌落于斜面培養(yǎng)基純化。

復(fù)篩：挑取純化后的菌株接入篩選培養(yǎng)基中，于37℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)，定時(shí)取培養(yǎng)液，進(jìn)行色譜檢測，分析菌株對(duì)扁桃酸的代謝情況。

1.3.2 培養(yǎng)

挑取篩選得到的菌種接種至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在35℃、160 r·min-1的恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h，以6%的接種量將培養(yǎng)液接種到裝液量50 mL/250 mL搖瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35℃、160 r·min-1的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，定期取樣檢測。

1.3.3 分析檢測

細(xì)胞生物量采用分光光度計(jì)通過濁度OD600測定。

扁桃酸、苯甲酰甲酸和苯甲酸的濃度采用高效液相色譜測定。色譜條件：色譜柱Agilent，RP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇∶磷酸緩沖溶液(6.6 g·L-1Na2HPO4，6.8 g·L-1KH2PO4)=1∶9(體積比)，流速1 mL·min-1，室溫，檢測波長210 nm。

參照文獻(xiàn)[14,15]用旋光儀檢測樣品的旋光度，并計(jì)算光學(xué)純度(OP)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種篩選

篩選得到12株可代謝扁桃酸菌株，其中4株可選擇性降解S-扁桃酸，49#菌活性最高，產(chǎn)物R-扁桃酸光學(xué)純度達(dá)到98%。該菌經(jīng)16S rDNA鑒定為銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)液的HPLC分析結(jié)果

以底物濃度為131.4 mmol·L-1的發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵36 h，取發(fā)酵液樣品進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見圖1，扁桃酸的代謝曲線見圖2。

圖1 發(fā)酵36 h時(shí)的代謝產(chǎn)物

由圖1可知，發(fā)酵液中主要含有扁桃酸(4.515 min)、苯乙酮酸(7.998 min)和苯甲酸(6.748 min)。因此，可推測此代謝途徑可能是S-扁桃酸經(jīng)脫氫酶氧化為苯乙酮酸，再經(jīng)脫羧、氧化成為苯甲酸，最后被逐步完全降解。這與Shimao等[16]報(bào)道的Pseudomonasputida代謝扁桃酸的途徑相似。

圖2 扁桃酸代謝曲線

從圖2可以看出，以131.4 mmol·L-1底物濃度進(jìn)行搖瓶發(fā)酵時(shí)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，扁桃酸的濃度迅速下降,48 h時(shí)降解50%后，扁桃酸濃度不再繼續(xù)下降，并基本保持不變，經(jīng)測定殘留扁桃酸為R-扁桃酸且光學(xué)純度為99%。代謝過程中兩個(gè)中間代謝產(chǎn)物的濃度都隨著扁桃酸濃度的變化而變化，苯乙酮酸和苯甲酸達(dá)到最大濃度的時(shí)間分別是26 h和34 h，48 h時(shí)S-扁桃酸被完全降解。

2.3 R-扁桃酸轉(zhuǎn)化方法的比較

采用三種轉(zhuǎn)化方式(底物終濃度65.7 mmol·L-1)對(duì)P.aeruginosa降解S-扁桃酸制備R-扁桃酸進(jìn)行了研究。(1)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體24 h后，收集菌體并重懸于同體積轉(zhuǎn)化液中搖床轉(zhuǎn)化；(2)直接發(fā)酵法。發(fā)酵培養(yǎng)基添加底物直接進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(3)添加底物發(fā)酵法。發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體24 h后，添加底物進(jìn)行發(fā)酵。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種方法完成轉(zhuǎn)化的時(shí)間分別為88 h、60 h和72 h。采用直接培養(yǎng)發(fā)酵法制備R-扁桃酸效率最高，且操作方便。

2.4 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

對(duì)P.aeruginosa發(fā)酵法制備R-扁桃酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源、金屬離子等進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：氮源中，有機(jī)氮優(yōu)于無機(jī)氮，但有機(jī)氮使菌體代謝產(chǎn)生大量堿性物質(zhì)，適量的無機(jī)氮可緩解此問題，選擇氮源的種類和用量為蛋白胨 3.5 g·L-1、酵母浸粉3.5 g·L-1、NH4Cl 4 g·L-1；金屬離子中，Mg2+和Zn2+對(duì)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用，其它金屬離子影響不明顯，選擇Mg2+和Zn2+的用量分別為0.5 g·L-1和0.4 g·L-1；碳源中，葡萄糖和甘油均可顯著提高菌體生物量，但葡萄糖嚴(yán)重抑制扁桃酸的代謝，而甘油在濃度較低時(shí)，菌體量大且苯甲酸積累少，有利于發(fā)酵，在濃度高于5 g·L-1時(shí)，則使得苯甲酸大量積累且代謝十分緩慢，選擇碳源為1 g·L-1甘油。

2.5 溫度對(duì)S-扁桃酸降解的影響(圖3)

圖3 溫度對(duì)P.aeruginosa的生長和代謝活性的影響

由圖3可以看出，在25～37℃的條件下，隨著溫度的升高，P.aeruginosa菌株代謝相對(duì)活性(基于37℃時(shí)最高代謝活力為1計(jì)算)逐漸增大;當(dāng)溫度為37℃時(shí)，相對(duì)活性達(dá)到最大值；溫度高于37℃時(shí)，活性迅速下降；45℃時(shí)細(xì)胞活性幾乎完全喪失。鑒于P.aeruginosa在培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)菌體生長最佳、生物量(OD600)最高，而37℃與35℃時(shí)S-扁桃酸代謝活性相差很小，選擇最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)化溫度為35℃。

2.6 pH值對(duì)S-扁桃酸降解的影響

由于P.aeruginosa適合在中性和微堿環(huán)境中生長。在pH值5.0以下和pH值11.0以上環(huán)境中不能生長；在pH值6.0～10.0范圍內(nèi)生長，且在pH值7.0～9.0時(shí)生長較好，生物量高。因此，研究pH值在6.0～10.0范圍內(nèi)對(duì)65.8 mmol·L-1外消旋扁桃酸降解的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 pH值對(duì)S-扁桃酸降解的影響

由圖4可以看出，隨著pH值的增大，S-扁桃酸降解速度逐漸減慢。pH值為6.0～7.0時(shí)，36 hS-扁桃酸降解完全(OP>99%)；pH值為7.5～8.5時(shí)，40～48 hS-扁桃酸降解完全(OP>99%)；而pH值為9.0～10.0時(shí)，S-扁桃酸降解速度緩慢，不能完全降解(OP<73%)。

由于苯甲酸是代謝過程中的限速步驟，最終以其降解完全確定培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的完成時(shí)間，隨著pH值的增大，苯甲酸的最大積累量減少，轉(zhuǎn)化完成時(shí)間縮短。pH值低(pH值6.0～7.0)時(shí)，菌體降解S-扁桃酸的活性強(qiáng)，大量生成中間代謝產(chǎn)物苯甲酸，可能高濃度的苯甲酸抑制菌體對(duì)苯甲酸的進(jìn)一步降解，苯甲酸降解緩慢，需要近70 h才能降解完全，從而致使S-扁桃酸的整個(gè)代謝過程時(shí)間較長；pH值呈微堿性(pH值7.5～8.5)時(shí)，菌體降解S-扁桃酸活性相對(duì)較弱，苯甲酸慢慢增加，在低濃度苯甲酸環(huán)境中，菌體降解苯甲酸的活性較高，苯甲酸54 h內(nèi)就被降解完全。因此，pH值對(duì)P.aeruginosa降解S-扁桃酸影響較大，最適pH值為8.0。

2.7 底物濃度對(duì)S-扁桃酸降解的影響(圖5)

圖5 底物濃度對(duì)發(fā)酵完成時(shí)間及光學(xué)純度的影響

由圖5可知，隨著底物濃度的增加，發(fā)酵完成時(shí)間延長；當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?31.4 mmol·L-1時(shí)，與發(fā)酵完成時(shí)間呈很好的線性關(guān)系(R2=0.9906)；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?31.4 mol·L-1時(shí)，68 h即完成發(fā)酵，光學(xué)純度達(dá)到99.2%(R-扁桃酸收率48.2%);而底物濃度高于131.4 mmol·L-1時(shí)，不僅完成發(fā)酵時(shí)間延長，而且光學(xué)純度也有所降低。這可能是由于底物濃度高于131.4 mmol·L-1時(shí),存在底物或中間產(chǎn)物抑制。

3 結(jié)論

以外消旋扁桃酸作為唯一碳源篩選得到一株高效對(duì)映選擇性降解S-扁桃酸的銅綠假單胞菌菌株。在溫度為35℃、pH值為8.0、接種量為6%、轉(zhuǎn)速為160 r·min-1、底物濃度為131.4 mmol·L-1的條件下，68 h完成發(fā)酵，R-扁桃酸收率為48.2%、光學(xué)純度為99.2%。該菌活性、底物耐受性及對(duì)映選擇性較高，S-扁桃酸及其代謝物被完全降解，簡化了產(chǎn)物分離提取步驟，而且消旋體扁桃酸價(jià)格低廉，因此利用微生物選擇性降解消旋體制備高附加值的光學(xué)純扁桃酸具有很好的工業(yè)化前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] Sargent B J,Heal D J,Fernandez M I.Therapeutic agents[P].USP 5 753 665,1998-05-19.

[2] Saravanan P,Singh V K.An efficient synthesis of chiral nonracemic diamines:Application in asymmetric synthesis[J].Tetrahedron Lett,1998,39(1-2):167-170.

[3] Stinson S C.Chiral pharmaceuticals[J].Chem Eng News,2001,79(40):79-97.

[4] Yadav G D,Sivakumar P.Enzyme-catalyzed optical resolution of mandelic acid viaR,S-(±)-methyl mandelate in non-aqueous media[J].Biochem Eng J,2004,19(2):101-107.

[5] Xiao Mei-Tian,Huang Ya-Yan,Ye Jing,et al.Study on the kinetic characteristics of the asymmetric production ofR-(-)-mandelic acid with immobilizedSaccharomycescerevisiaeFD11b[J].Biochemical Engineering Journal,2008,39(2):311-318.

[6] 黃雅燕,肖美添,郭養(yǎng)浩.微生物轉(zhuǎn)化苯乙酮酸合成R-(-)-扁桃酸[J].福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,34(3):435-447.

[7] Kim Byung-yong,Hwang Ki-chul,Song Hee-sang,et al.Optical resolution ofR,S-(±)-mandelic acid byPseudomonassp.[J].Biotechnology Letters,2000,22(23):1871-1875.

[8] 張輝,徐巖.微生物短桿菌(Brevibacteriumsp.)選擇性降解制備(R)-扁桃酸[J].過程工程學(xué)報(bào),2006,6(5):818-821.

[9] He Yu-Cai,Xu Jian-He,Pan Jiang,et al.Preparation of (R)-(-)-mandelic acid and its derivatives from racemates by enantioselective degradation with a newly isolated bacterial strainAlcaligenessp.ECU0401[J].Bioprocess Biosyst Eng,2008,31(5):445-451.

[10] Huang Han-Rong,Xu Jian-He.Preparation of (S)-mandelic acid from racemate using growing cells ofPseudomonasputidaECU1009 with (R)-mandelate degradation activity[J].Biochemical Engineering Journal,2006,30(1):11-15.

[11] Choi Won Jae,Lee Ki Young,Kang Sang Hyeon,et al.Biocatalytic enantioconvergent separation of racemic mandelic acid[J].Separation and Purification Technology,2007,53(2):178-182.

[12] Tsuchiya S,Miyamoto K,Ohta H.Highly efficient conversion of (±)-mandelic acid to its (R)-(-)-enantiomer by combination of enzyme-mediated oxidation and reduction[J].Biotechnol Lett,1992,14(12):1137-1142.

[13] Takahashi E,Nakamichi K,Furui M,et al.R-(-)-Mandelic acid production from racemic mandelic acids byPseudomonaspolycolorwith asymmetric degrading activity[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1995,79(5):439-442.

[14] Sigma-Aldrich Co. Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment[M].USA:Sigma-Aldrich Co.,2003-2004:1154.

[15] 臧健,王志軍,吳怡祖.扁桃酸的光學(xué)拆分[J].精細(xì)化工中間體,2005,35(1):50-52.

[16] Shimao M,Nakamura T,Okuda A,et al.Characteristics of transposon insertion mutants of mandelic acid-utilizingPseudomonasputidastrain A10 L[J].Biosci Biotechnol Biochem,1996,60(7):1051-1055.