裂褶菌多糖是從裂褶菌子實體、菌絲體或發(fā)酵液中提取出來的一種中性胞外多糖，是裂褶菌的主要功能成分，具有抑制腫瘤、抗輻射、提高機體免疫力等多種生理活性[1]。裂褶菌作為一種藥食用真菌，現(xiàn)已實現(xiàn)規(guī)模化固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，研究裂褶菌多糖的固態(tài)發(fā)酵動力學(xué)，對于探討其發(fā)酵機理、優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)、提高工業(yè)化生產(chǎn)效率具有重要意義。作者在此對裂褶菌多糖的固態(tài)發(fā)酵動力學(xué)進行研究，以期得到各參數(shù)之間的關(guān)系模型，為固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)裂褶菌多糖實現(xiàn)工業(yè)化提供依據(jù)。

1 實驗

1.1 菌種

裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)50875 菌株，自行篩選保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)[2]。

搖瓶種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖30，黃豆粉5，酵母浸膏粉2，KH2PO41,MgSO4·7H2O 0.5,VB10.001。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：80%麥麩+20%玉米芯(初始含水量為50%)。

1.3 培養(yǎng)方法

首先將菌種接種到斜面培養(yǎng)基，于27℃培養(yǎng)6 d；再接種到液體種子培養(yǎng)基，于27℃、180 r·min-1下培養(yǎng)60 h；最后接種到固體培養(yǎng)基，于27℃培養(yǎng)8 d。

1.4 分析與檢測

為了保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性，固體培養(yǎng)基統(tǒng)一制備、統(tǒng)一接種、混合均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中在同一培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，取樣時同時取3個培養(yǎng)瓶分別測定裂褶菌多糖含量、底物消耗量及菌體含量，取平均值。

1.4.1 裂褶菌多糖含量的測定

收集固態(tài)發(fā)酵物，60℃烘干6 h,粉碎；80℃水提，4200 r·min-1離心20 min，取上清液，加3 BV乙醇沉淀過夜；離心、收集醇沉物，定量分散；取分散液適當稀釋，采用苯酚-硫酸法[3]測定總多糖含量。

1.4.2 底物消耗量的測定[4]

取不同發(fā)酵時間的培養(yǎng)瓶，將其中的固態(tài)發(fā)酵物于60℃烘干至恒重，準確稱重，按下式計算底物消耗量。

1.4.3 菌體量的測定

菌體量的測定采用核酸法[5]。

1.5 計算工具軟件

采用 Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 裂褶菌多糖固態(tài)發(fā)酵過程中的代謝變化

對裂褶菌進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，每隔1 d取樣測定菌體生物量、多糖產(chǎn)量和底物消耗量，結(jié)果見圖1。

圖1 裂褶菌固態(tài)發(fā)酵過程代謝變化

由圖1可以看出，裂褶菌固態(tài)發(fā)酵過程中，菌體生長曲線呈“S”型，多糖產(chǎn)量同菌體的生長同步。表明該發(fā)酵過程屬于生長偶聯(lián)型[6]。

2.2 固態(tài)發(fā)酵動力學(xué)模型的建立

借鑒藥用真菌液體深層發(fā)酵的動力學(xué)模型，基于以下假設(shè)：(1)固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器內(nèi)溫度和濕度等參數(shù)衡定，生物量、基質(zhì)成分以及裂褶菌多糖的含量等亦均勻一致，即固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器是一個理想的全混反應(yīng)器；(2)菌體生長為均衡型非結(jié)構(gòu)式生長，細胞成分僅需用一個參數(shù)即菌體濃度表示即可；(3)培養(yǎng)基中只有一種底物是細胞生長限制性底物，其它營養(yǎng)成分及氧氣供應(yīng)不影響微生物的生長；(4)將微生物生長視為簡單反應(yīng)[7，8]。

2.2.1 菌體生長動力學(xué)模型

菌體生長曲線呈“S”型，可以用Logistic模型[6,9]來描述，即：

(1)

式中：X為細胞濃度,g·(100 g)-1；Xmax為最大細胞濃度,g·(100 g)-1；μmax為最大比生長速率,d-1。

2.2.2 多糖合成動力學(xué)模型

已知裂褶菌多糖合成屬于生長偶聯(lián)型，根據(jù)微生物產(chǎn)物合成動力學(xué)Luedeking-Pirct模型[8,9]，得

(2)

式中：P為產(chǎn)物濃度，g·(100 g)-1；α為與菌體生長量關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù),g·(100 g)-1·d-1。

2.2.3 底物消耗動力學(xué)模型

常用的底物消耗動力學(xué)模型是基于底物消耗物料恒算建立的方程式[8]：

(3)

式中：YX/S=ΔX/ΔS，細胞對基質(zhì)的得率系數(shù)，g·(100 g)-1；YP/S=ΔP/ΔS為產(chǎn)物對基質(zhì)的得率系數(shù)，g·(100 g)-1；S為底物量，%；Ke為細胞維持系數(shù)，單位質(zhì)量干細胞在單位時間內(nèi)維持代謝消耗的基質(zhì)量，g·(100 g)-1·d-1。

在固態(tài)發(fā)酵生成裂褶菌多糖的過程中，維持菌體代謝所消耗的底物量很有限，因此認為底物消耗主要用于菌體生長和多糖的合成，所以(3)式可以簡化為：

(4)

2.3 動力學(xué)模型的求解擬合

2.3.1 菌體生長動力學(xué)模型求解

在式(1)中，t=0時，X=X0，積分得到：

Xt=X0exp(μmaxt)/{1-(X0/Xmax)[1-exp(μmaxt)]}

(5)

由實驗數(shù)據(jù)直接讀出X0=2.07 g·(100 g)-1、Xmax=6.82 g·(100 g)-1，以ln[Xt/(Xmax-Xt)]對時間t作圖，其斜率即為μmax，得到μmax=0.7385 d-1。得到裂褶菌多糖固態(tài)發(fā)酵過程中菌體生長的動力學(xué)模型為：

Xt=2.07exp(0.7385t)/{1-0.3035[1-exp(0.7385t)]}

(6)

用Origin 8.0軟件對裂褶菌菌絲體生長的實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合，結(jié)果見圖2，其中R=0.99256，表明所選模型準確地反映了菌體生長的實際情況。

圖2 裂褶菌菌體生長擬合曲線

2.3.2 多糖合成動力學(xué)模型求解

將式(1)代入式(2)中，積分得：

Pt=P0+α(Xt-X0)

(7)

以Pt對(Xt-X0)作圖,可得斜率α=1.9493，而P0=0 g·(100 g)-1,已知X0=2.07 g·(100 g)-1，那么多糖合成的動力學(xué)模型為：

Pt=1.9493(Xt-2.07)

(8)

對裂褶菌多糖產(chǎn)量的實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合,結(jié)果見圖3，其中R=0.99163，表明所選模型很好地反映了多糖合成的實際情況。

圖3 裂褶菌多糖合成擬合曲線

2.3.3 底物消耗動力學(xué)模型求解

將式(1)代入式(4)中，積分得：

St=S0-b2(Xt-X0)

(9)

式中：b2=1/YX/S。

以St對(Xt-X0)作圖，得：S0= 0.3766，b2=-0.6458，已知X0=2.07 g·(100 g)-1，得底物消耗的動力學(xué)模型為：

St=0.3766+0.6458(Xt-2.07)

(10)

對底物消耗的實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合,結(jié)果見圖4，其中R=0.98835，表明所選模型較好地反映了底物消耗的實際情況。

圖4 底物消耗擬合曲線

3 結(jié)論

通過對裂褶菌多糖發(fā)酵過程的研究，發(fā)現(xiàn)裂褶菌菌體生長和多糖的合成屬于生長偶聯(lián)型，即隨著菌體生長，底物被迅速利用，并在菌體生長過程中合成多糖?；贚ogistic方程和Luedeking-Pirct方程，結(jié)合數(shù)學(xué)推導(dǎo)并應(yīng)用Origin 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理計算，得到了菌體生長、多糖合成和底物消耗的動力學(xué)模型及其參數(shù)，結(jié)果表明該模型與實驗數(shù)據(jù)能較好地擬合。

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