16α,17α-環(huán)氧黃體酮(16α,17α-Epoxyprogesterone，EP)全稱(chēng)為16α,17α-環(huán)氧孕甾-4-烯-3,20-二酮，又名沃式氧化物，白色結(jié)晶粉末，無(wú)臭，微溶于乙醇、甲醇、甲苯。利用微生物進(jìn)行C11α-羥基化是甾體生物轉(zhuǎn)化中的一個(gè)重要反應(yīng)[1]，得到的C11α-羥基化產(chǎn)物是合成地塞米松、強(qiáng)的松龍等藥物的重要中間體。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用于16α,17α-環(huán)氧黃體酮C11α-羥基化的微生物生產(chǎn)菌種主要有黑根霉(Rhizopusnigricans)[2～4]、雅致小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)[5]和綠僵菌(Metarhiziumsp.)[6]等，產(chǎn)率一般在45%～75%之間，對(duì)發(fā)酵條件及操作要求較高且副產(chǎn)物種類(lèi)較多。

作者就赭曲霉(Aspergillusochraceus)405轉(zhuǎn)化16α,17α-環(huán)氧黃體酮的C11α-羥基化工藝進(jìn)行了研究，并將羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)應(yīng)用于該反應(yīng)中，提高了轉(zhuǎn)化率。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

16α,17α-環(huán)氧黃體酮，天津津津藥業(yè)有限公司；其它試劑均為市售分析純。

Agilent1100型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；HP-β-CD(取代度6.52)，西安德立生物化工有限公司。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

菌種：赭曲霉(Aspergillusochraceus)405，天津科技大學(xué)微生物制藥研究室保藏。

斜面培養(yǎng)基(g·L-1)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20，酵母膏1，pH值自然。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖30，玉米漿40，蠶蛹粉2，硫酸銨1.5，pH值6.4。

1.3 16α,17α-環(huán)氧黃體酮的C11α-羥基化反應(yīng)

將斜面菌種于28℃ 培養(yǎng)7 d，無(wú)菌水洗下孢子，制成濃度為5×107個(gè)·mL-1的孢子溶液，取一定量接種于50 mL/250 mL三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)28 h，加入10 g·L-1EP，繼續(xù)轉(zhuǎn)化48 h。

1.4 HP-β-CD的添加方式

稱(chēng)取與EP不同摩爾比的HP-β-CD，用紫外線(xiàn)滅菌30 min后分別加入到發(fā)酵液中。

1.5 相溶解度的測(cè)定

配制一系列濃度的 HP-β-CD 溶液，各取10 mL于具塞試管，加過(guò)量的EP，在搖床上28℃、200 r·min-1恒溫振蕩24 h。取上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜法測(cè)定其濃度，以EP濃度為縱坐標(biāo)、HP-β-CD濃度為橫坐標(biāo)，繪制相溶解度圖。

1.6 轉(zhuǎn)化率測(cè)定

取2 mL發(fā)酵液加入4 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，離心，精確取上清液0.1 mL于1.5 mL的小離心管中，自然風(fēng)干后加1 mL流動(dòng)相，12 000 r·min-1離心10 min。然后用高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜柱為Phenomenex C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相為甲醇∶水=80∶20(體積比)；流速1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL；外標(biāo)法檢測(cè)。轉(zhuǎn)化率依下式計(jì)算：

式中：X為液相測(cè)得的產(chǎn)物濃度，mg·L-1；d為稀釋倍數(shù)；V為發(fā)酵液的體積,L；mEP為V體積內(nèi)底物的質(zhì)量,mg；MEP與M產(chǎn)物分別為底物與產(chǎn)物的摩爾質(zhì)量，g·mol-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)轉(zhuǎn)化體系的影響主要包括溶氧和剪切力兩方面，提高轉(zhuǎn)速可以強(qiáng)化底物和氧氣在菌體發(fā)酵體系中的傳質(zhì)，促進(jìn)酶與底物的充分接觸。但隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，剪切力也相應(yīng)增大，會(huì)將菌絲打碎，反而不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)?？疾鞊u床轉(zhuǎn)速對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖1可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r·min-1時(shí)，赭曲霉菌球大小一致，轉(zhuǎn)化率最高，最適宜轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行。

2.2 接種量對(duì)C11α-羥基化反應(yīng)的影響

配制濃度為5×107個(gè)·mL-1的赭曲霉孢子懸浮液，以不同接種量接種，考察接種量對(duì)C11α-羥基化反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，接種量較小，菌球大而數(shù)量少；隨接種量增大，搖瓶?jī)?nèi)菌球變小、數(shù)量增加，發(fā)酵液逐漸呈粥狀。轉(zhuǎn)化率也隨著接種量和搖瓶中菌球形態(tài)的不同而不同，接種量為2.0%時(shí)轉(zhuǎn)化率最高達(dá)72.6%，此時(shí)，搖瓶中菌球呈小米狀。

表1 接種量對(duì)EP C11α-羥基化反應(yīng)的影響

2.3 底物投料方式對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

考察了不同底物投料方式對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。(1)有機(jī)溶劑助溶法：分別用甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇、DMF、DMSO溶解EP，所有溶劑均按照4%的比例添加，然后超聲振蕩處理5 min以加速EP在溶劑中的分散，加入到已培養(yǎng)好的菌體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。(2)吐溫80乳化法：用吐溫80溶液高溫乳化EP后，超聲振蕩5 min，然后加入到已培養(yǎng)好的菌體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。(3)干粉投料法：將EP紫外滅菌后直接加入到已培養(yǎng)好的菌體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 底物投料方式對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖2可知，用乙醇溶解EP后進(jìn)行超聲振蕩處理的投料方式的轉(zhuǎn)化率最高，為74.2%。

2.4 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基初始pH值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

赭曲霉轉(zhuǎn)化EP，是利用胞內(nèi)酶的作用，而酶與底物的作用必須有合適的pH值。另外，培養(yǎng)基初始pH值影響跨膜pH值梯度，影響膜的通透性，進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物的生成，是生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一[4]?？疾斐跏紁H值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基初始pH值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖3可知，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基初始pH值為5.0時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高。

2.5 底物投加時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

羥化酶為誘導(dǎo)酶，底物的添加時(shí)間往往對(duì)轉(zhuǎn)化效果產(chǎn)生顯著影響。選取在快速生長(zhǎng)期內(nèi)的不同時(shí)期加入EP進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，考察底物投加時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 底物投加時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖4可知，在28 h左右進(jìn)行投料的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)80.3%。

2.6 底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響(圖5)

圖5 底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖5可知，轉(zhuǎn)化率隨底物濃度的增加而顯著降低，底物濃度較低時(shí)(10 g·L-1)的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)80.5%。

2.7 環(huán)糊精添加比例對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

環(huán)糊精能顯著增加EP等疏水化合物的水溶性，在一定范圍內(nèi)其溶解度的增加與環(huán)糊精的添加量呈線(xiàn)性關(guān)系(圖6)。在轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行4 h時(shí)添加與EP不同摩爾比的HP-β-CD，28℃、200 r·min-1反應(yīng)48 h,結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖6 EP在HP-β-CD溶液中的相溶解圖

圖7 HP-β-CD與EP摩爾比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖7可知，加入與EP摩爾比為(0.25～1.25)∶1的HP-β-CD時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率隨著HP-β-CD加量的增大而上升；n(HP-β-CD)∶n(EP)為1.25∶1時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，為93.1%，較未添加HP-β-CD的轉(zhuǎn)化率提高了12.6%;繼續(xù)增加HP-β-CD的量，轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)而下降。

3 結(jié)論

確定了利用赭曲霉進(jìn)行16α,17α-環(huán)氧黃體酮的C11α-羥基化的最佳轉(zhuǎn)化條件如下：轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基初始pH值為5.0、接種量為2.0%、搖床轉(zhuǎn)速為200 r·min-1、培養(yǎng)28 h時(shí)投加用乙醇溶解的EP、EP濃度為10 g·L-1，此條件下轉(zhuǎn)化率達(dá)80.5%。在轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行4 h時(shí)添加與EP摩爾比為1.25∶1的HP-β-CD，轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.1%，較未添加HP-β-CD的轉(zhuǎn)化率提高了12.6%。

參考文獻(xiàn)：

[1] Fernandes P，Cruz A，Angelova B，et al．Microbial conversion of steroid compounds：Recent developments[J]．Enzyme and Microbial Technology，2003，32(6)：688-705．

[2] 杜大慶，劉玲玲，張星元，等．黑根霉對(duì)甾體的C11α-羥基化反應(yīng)[J]．河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，27(3):70-74.

[3] 萬(wàn)金營(yíng)，杜連祥，鞏培，等．雙液相體系下對(duì)黑根霉C11α-羥基化16α,17α-環(huán)氧孕酮的研究[J]．天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，24(2):13-16．

[4] Roglic U， Znidarsic-Plazl P，Plazl I．The influence ofβ-cyclodextrin on the kinetics of progesterone transformation byRhizopusnigricans[J]．Biocatalysis and Biotransformation，2005，23(5)：299-305．

[5] 徐銀，陳小龍，鄭裕國(guó)．雅致小克銀漢霉對(duì)16α,17α-環(huán)氧黃體酮C11α-羥基化的工藝研究[J]．中國(guó)生化藥物雜志，2009，30(4):239-242．

[6] 李安華，王藝軍，王明道，等．綠僵菌羥基化16α,17α-環(huán)氧黃體酮的工藝研究[J]．河南科學(xué)，2007，25(5)：754-757．