過亞硝酸根(ONOO-)是生物體的一類內(nèi)源性細(xì)胞毒素，具有強(qiáng)烈的氧化和硝化作用，能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等生物大分子的損傷，與心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥及癌癥密切相關(guān)[1,2]。如何抑制過亞硝酸根毒性一直是此領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在過亞硝酸根抑制劑的研究中，金屬卟啉類抑制劑因其清除速度快、效率高等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。

1996年，Stern等[3]首次發(fā)現(xiàn)水溶性鐵卟啉能夠有效催化過亞硝酸根的分解，從而抑制過亞硝酸根的毒性，引發(fā)了金屬卟啉清除過亞硝酸根的研究熱潮。近年來，各國(guó)學(xué)者開始研究以金屬卟啉為代表的多種金屬化合物催化過亞硝酸根分解的原理，并積極尋找和合成更多、更好的清除過亞硝酸根的大分子金屬化合物。

作者在此以氯化-四(對(duì)羧基苯基)錳卟啉[T(p-COOH)PPMnCl]為對(duì)象，研究新型錳卟啉在生理?xiàng)l件下催化過亞硝酸根分解和硝化酪氨酸的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。對(duì)過亞硝酸根毒性抑制劑的研究及過亞硝酸根相關(guān)疾病藥物的開發(fā)具有積極的意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

過亞硝酸根溶液按照1995年Uppu等[4]提出的兩相反應(yīng)體系過氧化氫與亞硝酸異戊酯的取代反應(yīng)來制備。每次實(shí)驗(yàn)前用紫外可見分光光度計(jì)在302 nm測(cè)定過亞硝酸根的吸光度，根據(jù)ε302=1670 L·mol-1·cm-1計(jì)算過亞硝酸根濃度。

卟啉配體參照文獻(xiàn)[5]合成。金屬卟啉參照文獻(xiàn)[6]合成，收率為90%～95%，合成的錳卟啉結(jié)構(gòu)見圖1。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

U3010型紫外可見分光光度計(jì)，日本日立公司；SFM-300/MOS-250型停留動(dòng)力學(xué)與光譜分析系統(tǒng)、Bio-Kine 32 V4.27動(dòng)力學(xué)曲線模擬軟件，法國(guó)比奧羅杰公司。

圖1 錳卟啉結(jié)構(gòu)圖

1.2 方法

1.2.1 生理?xiàng)l件下，錳卟啉催化過亞硝酸根分解的動(dòng)力學(xué)研究

在過亞硝酸根濃度為400 μmol·L-1、錳卟啉濃度為10 μmol·L-1、生理?xiàng)l件下，利用停留動(dòng)力學(xué)裝置研究錳卟啉催化過亞硝酸根分解的動(dòng)力學(xué)。在302 nm處測(cè)定過亞硝酸根的吸光度[4]，得到錳卟啉催化過亞硝酸根分解的動(dòng)力學(xué)曲線，表觀速率常數(shù)由動(dòng)力學(xué)軟件Bio-Kine擬合計(jì)算得出。每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行7次。

在37℃，研究不同濃度的錳卟啉催化過亞硝酸根分解的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。錳卟啉的濃度分別為0 μmol·L-1、2 μmol·L-1、6 μmol·L-1、10 μmol·L-1、14 μmol·L-1，過亞硝酸根濃度為400 μmol·L-1。用動(dòng)力學(xué)軟件Bio-Kine模擬分解曲線得到表觀速率常數(shù)。

分別在4℃、15℃、25℃、37℃、45℃測(cè)定10 μmol·L-1錳卟啉催化400 μmol·L-1過亞硝酸根分解的表觀速率常數(shù)。通過Arrhenius定理lnk=lnA-(Ea/RT)，求得活化能Ea。

1.2.2 生理?xiàng)l件下，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸的動(dòng)力學(xué)研究

利用紫外可見分光光度法，測(cè)定生理?xiàng)l件下不同濃度錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的生成量，以此考察錳卟啉生理?xiàng)l件下催化過亞硝酸根硝化酪氨酸的效果。在37℃,將1 mmol·L-1酪氨酸和不同濃度(0 μmol·L-1、2 μmol·L-1、6 μmol·L-1、10 μmol·L-1、14 μmol·L-1)錳卟啉溶于pH值7.4的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液中，37℃水浴，劇烈攪拌，分滴(間隔30 s)加入過亞硝酸根溶液，使過亞硝酸根終濃度為1 mmol·L-1，反應(yīng)30 min,根據(jù)3-NT在480 nm處的吸光度值(ε480=2200 L·mol-1·cm-1)[7]計(jì)算3-NT的濃度。

在過亞硝酸根濃度為50 μmol·L-1、酪氨酸濃度為1 mmol·L-1、生理?xiàng)l件下，利用停留動(dòng)力學(xué)裝置研究不同濃度(0 μmol·L-1、2 μmol·L-1、6 μmol·L-1、10 μmol·L-1、14 μmol·L-1)錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的動(dòng)力學(xué)。在418 nm處測(cè)定3-NT的吸光度[7]，得到錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的動(dòng)力學(xué)曲線，表觀速率常數(shù)由動(dòng)力學(xué)軟件Bio-Kine擬合計(jì)算得出。每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行7次。

分別在4℃、15℃、25℃、37℃、45℃測(cè)定10 μmol·L-1錳卟啉催化500 μmol·L-1過亞硝酸根硝化1 mmol·L-1酪氨酸生成3-NT的表觀速率常數(shù)。通過Arrhenius定理，求得活化能Ea。

2 結(jié)果與討論

2.1 生理?xiàng)l件下，錳卟啉催化過亞硝酸根分解的動(dòng)力學(xué)研究

利用停留技術(shù)研究了37℃生理?xiàng)l件下錳卟啉催化過亞硝酸根分解的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，動(dòng)力學(xué)衰減曲線如圖2所示。

圖2 生理?xiàng)l件下，錳卟啉催化過亞硝酸根分解的動(dòng)力學(xué)曲線

由圖2可見，生理?xiàng)l件下錳卟啉存在時(shí)，過亞硝酸根的分解顯著加快。通過動(dòng)力學(xué)軟件，得到37℃下無錳卟啉時(shí)(圖1a),過亞硝酸根分解的表觀速率常數(shù)kobs為1.34 s-1,根據(jù)公式t1/2=ln2/kobs，計(jì)算得到過亞硝酸根自發(fā)分解的半衰期為0.52 s；有錳卟啉時(shí)(圖1b)，表觀速率常數(shù)kobs為8.29 s-1，半衰期為0.08 s。與無錳卟啉相比，過亞硝酸根分解反應(yīng)速率常數(shù)增大、半衰期縮短，說明錳卟啉促進(jìn)了過亞硝酸根的分解。

在37℃生理?xiàng)l件下,不同濃度的錳卟啉催化400 μmol·L-1過亞硝酸根分解的表觀速率常數(shù)如圖3所示。

圖3 37℃下不同濃度錳卟啉催化400 μmol·L-1過亞硝酸根分解的表觀速率常數(shù)

由圖3可見，在生理?xiàng)l件下,隨著錳卟啉濃度的增加,錳卟啉催化過亞硝酸根分解的表觀速率常數(shù)呈線性增大。表觀速率常數(shù)kobs=k0+kcat[Catalyst]，其中k0為空白時(shí)的表觀速率常數(shù)、kcat為催化活性，由直線斜率即可得到錳卟啉的kcat為7.23×105L·mol-1·s-1。

分別在4℃、15℃、25℃、37℃、45℃下，測(cè)定錳卟啉催化過亞硝酸根分解的表觀速率常數(shù)，繪制過亞硝酸根分解的阿倫尼烏斯曲線，如圖4所示。

圖4 10 μmol·L-1錳卟啉催化400 μmol·L-1過亞硝酸根分解的阿倫尼烏斯曲線

利用阿倫尼烏斯定理，求得錳卟啉催化過亞硝酸根分解的活化能Ea為27.6 kJ·mol-1,而過亞硝酸根自發(fā)分解的活化能為80.8 kJ·mol-1。說明錳卟啉使過亞硝酸根分解的活化能降低，加快了過亞硝酸根分解的速率。

2.2 生理?xiàng)l件下，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸的動(dòng)力學(xué)研究

不同濃度錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸的3-NT生成量如圖5所示。

圖5 不同濃度錳卟啉下3-NT的生成量

由圖5可知，3-NT的濃度隨著錳卟啉濃度的增加而增大，當(dāng)錳卟啉濃度從0增加至14 μmol·L-1時(shí)，3-NT的濃度從0.09 μmol·L-1升至0.21 μmol·L-1，增加了133%?？梢娚?xiàng)l件下，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸的能力較大。

在37℃生理?xiàng)l件下，不同濃度錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的表觀速率常數(shù)如圖6所示。

圖6 37℃下不同濃度錳卟啉催化3-NT生成的表觀速率常數(shù)

由圖6可知，在生理?xiàng)l件下，隨著錳卟啉濃度的增加，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的表觀速率常數(shù)呈線性增大。表觀速率常數(shù)kobs=k0+kcat[Catalyst]，由直線斜率即可得到錳卟啉的kcat為5.24×105L·mol-1·s-1。

分別在4℃、15℃、25℃、37℃、45℃，測(cè)定錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的表觀速率常數(shù)，繪制錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的阿倫尼烏斯曲線，如圖7所示。

圖7 10 μmol·L-1錳卟啉催化500 μmol·L-1過亞硝酸根硝化1 mmol·L-1酪氨酸的阿倫尼烏斯曲線

利用阿倫尼烏斯定理，通過動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)求得錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的活化能Ea為40.1 kJ·mol-1;而過亞硝酸根硝化游離酪氨酸的活化能為75.3 kJ·mol-1。說明錳卟啉使過亞硝酸根硝化酪氨酸的活化能降低，加快了過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的速率。

3 結(jié)論

利用停留技術(shù)和快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法，測(cè)定了生理?xiàng)l件下,錳卟啉催化過亞硝酸根分解的催化反應(yīng)速率常數(shù)kcat為7.23×105L·mol-1·s-1，活化能Ea為27.6 kJ·mol-1，與空白實(shí)驗(yàn)比較，活化能顯著降低，說明生理?xiàng)l件下，錳卟啉催化過亞硝酸根分解的效果明顯；測(cè)定了生理?xiàng)l件下，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的催化反應(yīng)速率常數(shù)kcat為5.24×105L·mol-1·s-1，活化能Ea為40.1 kJ·mol-1，與空白實(shí)驗(yàn)比較，活化能顯著降低，說明生理?xiàng)l件下，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的效果明顯。

參考文獻(xiàn)：

[1] Szabo C,Ischiropoulos H，Radi R.Peroxynitrite:Biochemistry,pa-thophysiology and development of therapeutics[J].Nature Reviews Drug Discovery,2007,6(8):662-680.

[2] Szabo C.Peroxynitrite:Biochemistry,toxicology and development of therapeutics[J].Toxicol Lett,2009,189(S1):S22.

[3] Stern M K,Jensen M P,Kramer K.Peroxynitrite decomposition catalysts[J].J Am Chem Soc,1996,118(36):8735-8736.

[4] Uppu R M,Pryor W A.Synthesis of peroxynitrite in a two-phase system using isoamyl nitrite and hydrogen peroxide[J].Anal Biochem,1996,236(2):242-249.

[5] Adler A D,Longo F R,Finarelli J D,et al.A simplified synthesis for meso-tetraphenylporphine[J].J Org Chem,1967,32(2):476.

[6] Guo Can-Cheng,Gui Ming-De,Zhu Shen-Jie.Studied on synthesis of ironporphyrins and cyclohexane hydroxylation catalyzed by ironporphyrins[J].J Chin J Org Chem,1994,14(2):163-170.

[7] Greenacre S A,Ischiropoulos H.Tyrosine nitration:Localisation,quantification,consequences for protein function and signal transduction[J].Free Radic Res,2001,34(6):541-581.