， ，

(1.遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧 撫順 113001；2.中國石化撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001)

菌種保藏的主要目的在于能在較長時間內(nèi)保持菌種的生存，保持菌種在遺傳、形態(tài)和生理上的穩(wěn)定性[6]。同時，還要保持菌種的物種獨立性，使其免受其它微生物的侵染，保持純培養(yǎng)狀態(tài)[7]。其原理主要是根據(jù)微生物的生理、生化特點，人為創(chuàng)造低溫、干燥或缺氧條件，抑制微生物的代謝作用，使其生命活動降至最低程度或處于休眠狀態(tài)，使菌株很少發(fā)生突變，以達(dá)到保持純種的目的[8]。

菌種保存的方法有很多，如斜面保存、液體石蠟保存、冷凍干燥保存、液氮超低溫保存、干燥保存等等。由于硝化菌的降解能力和保藏能力是影響其商品化的兩個重要因素[9]，所以本實驗旨在尋找硝化菌的最佳保存方法。

1 實驗

1.1 儀器

可見分光光度計,韓國新科儀器制造公司;恒溫水浴鍋,北京順杰欣隆科技有限公司;電子分析天平,德國天平儀器公司。

1.2 硝化作用原理

在好氧條件下，通過亞硝化菌和硝化菌的作用，將氨氮氧化成亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程,稱為生物硝化作用。生物硝化的反應(yīng)過程為：

由上式可知:(1) 在硝化過程中，1 g氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮時需氧4.57 g；(2)硝化過程中釋放出H+，將消耗廢水中的堿度，每氧化1 g氨氮，將消耗堿度(以CaCO3計)7.1 g。

影響硝化過程的主要因素有：(1)pH值，當(dāng)pH值為8.0～8.4時(20℃)，硝化作用速度最快。硝化過程中pH值在7.5以上。(2)溫度，溫度高時硝化速度快。亞硝化菌的最適宜水溫為35℃，在15℃以下其活性急劇降低，故水溫不宜低于15℃。

1.3 硝化活性評價培養(yǎng)基(NBM，氨氮濃度150 mg·L-1)

培養(yǎng)基組成：(NH4)2SO42.1 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，CaCl20.3 g·L-1，MgSO40.3 g·L-1， FeSO417 mg·L-1，EDTA 8 mg·L-1。

1.4 氨氮濃度的測定

氨氮濃度測定采用納氏比色法，參照GB/T 7479-1987。

1.5 比硝化活性(NA)的測定

比硝化活性(NA， g·kg-1·h-1)定義為單位質(zhì)量(kg)硝化菌在單位時間(h)內(nèi)消耗的氨氮質(zhì)量(g)。

取1 g新鮮培養(yǎng)或保存后的硝化菌群濃縮液接種于300 mL NBM培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，反應(yīng)器有效體積為500 mL，氣升式攪拌，通氣量為2 L·min-1，分別在接種前和培養(yǎng)48 h后測定反應(yīng)體系中的氨氮濃度( mg·L-1)，記為c0和c1，按式(1)計算NA。

(1)

1.6 硝化活性保持率(RNA)的測定

RNA指保存后硝化菌的硝化活性(NA1)占新培養(yǎng)硝化菌的硝化活性(NA0)的百分比，見式(2)。

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 氨氮濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照GB/T7479-1987方法測定反應(yīng)液的OD值，以氨氮濃度(ca， mg·L-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(OD)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，擬合回歸方程為OD=4.957ca-0.011。

圖1 OD值與氨氮濃度之間的關(guān)系

2.2 室溫保存的硝化菌活性考察

取新鮮培養(yǎng)和室溫保存7 d、21 d、28 d、42 d的硝化菌群濃縮液，測定比硝化活性，結(jié)果見圖2。

圖2 硝化菌活性隨室溫保存時間變化趨勢

從圖2可知，隨著保存時間的延長，硝化菌的活性急劇下降，新鮮培養(yǎng)和室溫保存7 d、21 d、28 d、42 d的硝化菌的比硝化活性(g·kg-1·h-1)分別為0.46、0.38、0.25、0.19、0.03，平均每天降低0.0101 g·kg-1·h-1，半衰期為22.45 d。

由于在常溫下保存硝化菌的活性沒有受到抑制，而且硝化菌在保存之前經(jīng)過濃縮，菌體的密度相對較高，導(dǎo)致了在保存過程中隨著時間延長，硝化菌嚴(yán)重缺氧致死。另外，由于實驗室培養(yǎng)的硝化菌并非純的自養(yǎng)硝化菌，而是一個以自養(yǎng)硝化菌占優(yōu)勢的菌群，菌群中還存在少量反硝化菌。反硝化菌比較適合在無氧的條件下生長，而且屬于異養(yǎng)菌，生長時需要碳源，因此在保存過程中隨著體系中的氧氣消耗殆盡，反硝化菌對死掉的硝化菌起到了腐敗的作用，所以在室溫保存一個月左右的時候，整個保存體系會逐漸變黑，而且氣味發(fā)臭，這也是進(jìn)一步加速菌群硝化活性降低的原因之一。 由此可見，室溫保藏硝化菌的方法只適合硝化菌的短期保存。

2.3 不同溫度保存的硝化菌活性考察

由于室溫僅適合短期保存硝化菌，因此考察了其它溫度條件下保存硝化菌的活性。取新培養(yǎng)和分別在4℃、20℃、30℃、35℃條件下保存28 d的硝化菌群濃縮液，測定比硝化活性，計算硝化活性保持率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同溫度保存的硝化菌活性保持率

從圖3可知，4℃、20℃、30℃和35℃保存28 d的硝化菌的活性保持率分別為58.59%、52.97%、34.89%和8.63%。由此可見，在不結(jié)冰的前提下，20℃以下保存硝化菌活性相對損失較小，20℃以上則不利于長期保存，4℃條件最好。任杰等[9]研究發(fā)現(xiàn)在不同溫度下保存的硝化菌隨著保藏溫度的升高，其衰弱指數(shù)逐漸增大，半衰期逐漸縮短，這與本實驗的結(jié)果相符。

2.4 4℃冷藏的硝化細(xì)菌活性考察

取新培養(yǎng)和冰箱中4℃冷藏28 d、42 d、90 d和180 d的硝化菌群濃縮液，測定比硝化活性，結(jié)果見圖4。

圖4 硝化菌活性隨4℃保存時間變化趨勢

從圖4可知，隨著保存時間的延長，硝化菌的活性逐漸下降，但是與室溫保存相比，活性下降的速率較慢。新培養(yǎng)和冰箱中4℃冷藏28 d、42 d、90 d和180 d的硝化菌群濃縮液的比硝化活性(g·kg-1·h-1)分別為0.46、0.27、0.18、0.10和0.02，半衰期為36.68 d。

由于硝化菌在4℃條件下代謝活動降低或接近于停止，維持生命所需的氧氣較少或甚至不需要，而且反硝化菌等雜菌在這種條件下不能生長，因此4℃條件保存時間比室溫更長，比較適合用于硝化菌的中期(1～2個月)保存。

2.5 加培養(yǎng)基保存的硝化菌活性考察

考察了保存體系中加入NBM培養(yǎng)基對保持硝化菌活性的影響，取新培養(yǎng)和在4℃與室溫條件下加培養(yǎng)基或不加培養(yǎng)基保存28 d的硝化菌群濃縮液，測定比硝化活性，計算硝化活性保持率，結(jié)果見圖5。

圖5 保存體系加培養(yǎng)基對保持硝化菌活性的影響

從圖5可知，無論室溫或4℃保存，體系中加入NBM培養(yǎng)基都有利于硝化活性的保持。室溫下未加培養(yǎng)基、室溫下加培養(yǎng)基、4℃未加培養(yǎng)基和4℃加培養(yǎng)基保存28 d的硝化菌群的硝化活性保持率分別為40.32%、55.94%、58.59%和67.23%?？梢娂优囵B(yǎng)基后，室溫和4℃保存的活性保持率分別提高了15.62%和8.64%。因此可以推測，加培養(yǎng)基后室溫和4℃保存的半衰期將分別向后推遲15.62%和8.64%。加培養(yǎng)基比不加培養(yǎng)基能保持更多的硝化活性，是因為培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分為硝化菌提供了代謝所需的必要物質(zhì)保障，而加培養(yǎng)基條件下常溫保存和4℃保存相比，硝化活性保持率提高得更多(分別為15.62%和8.64%)，這可能是因為常溫條件下硝化菌的代謝活動遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于4℃條件所致。

2.6 -20℃凍存的硝化細(xì)菌活性考察

2.6.1 選擇凍存保護(hù)劑

考察了甘油和二甲基亞砜(DMSO)為保護(hù)劑凍存硝化菌群保持活性的效果。甘油和DMSO加入量(質(zhì)量比)為10%，保存溫度為-20℃，保存時間為28 d。取新培養(yǎng)和保存后的硝化菌群濃縮液，測定比硝化活性，結(jié)果見圖6。

圖6 甘油和DMSO為保護(hù)劑對凍存后硝化菌活性的影響

從圖6可看出，以甘油或DMSO為保護(hù)劑，-20℃條件凍存28 d后，比硝化活性(g·kg-1·h-1)分別為0.45和0.42，比新培養(yǎng)的硝化菌群分別僅降低2.2%和8.7%?？梢?，甘油和DMSO作為保護(hù)劑都能保持硝化菌的活性，其中甘油效果更好。甘油和DMSO能作為硝化菌群凍存保護(hù)劑的原因可能是因為它們可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，使得細(xì)胞脫水而保護(hù)細(xì)胞不被凍裂。

2.6.2 硝化活性隨凍存時間變化的趨勢

以甘油為保護(hù)劑，-20℃條件凍存的硝化菌群分別于1、4、8、12、18、24和36個月后取樣分析其硝化活性，見圖7。

NA=0.4533 e-0.0213t

(3)

圖7 硝化活性隨凍存時間變化的趨勢

從圖7可知，隨著凍存時間的延長，硝化活性呈遞減趨勢[式(3)]，但與室溫和4℃保存的硝化細(xì)菌活性相比，降低的速率相對較慢，其半衰期為31.85個月，約955.5 d。由于保護(hù)劑甘油的存在使得硝化菌在結(jié)凍時免于因細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰造成細(xì)胞裂解，同時又因為處在-20℃的低溫環(huán)境，細(xì)胞停止了一切代謝活動，不會因為細(xì)胞密度、營養(yǎng)等因素而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，能夠很好地保持硝化菌的生命特征，從而維持其硝化活性。因此，相比室溫和4℃保存，-20℃凍存適合于硝化菌的長期(2～3年)保存。

3 結(jié)論

通過對不同溫度以及加入培養(yǎng)基和保護(hù)劑等條件下保存后的硝化菌活性進(jìn)行分析，得到3種合適的硝化菌保存方法，分別為：

(1)室溫保存的硝化活性半衰期為22.45 d，適合硝化菌的短期保存。保存體系中加入NBM培養(yǎng)基能夠延長半衰期15.62%，即達(dá)到28.71 d。

(2)4℃保存的硝化活性半衰期為36.68 d，適合硝化菌的中期保存。保存體系中加入NBM培養(yǎng)基能夠延長半衰期8.64%，即達(dá)到39.83 d。

(3)以甘油為保護(hù)劑，-20℃保存的硝化活性半衰期為955.5 d，適合硝化菌的長期保存。

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