韓琳娜，周鳳琴

（山東中醫(yī)藥大學藥學院，濟南250355）

大豆(Glycine max（Linn.）Merr.)是我國主要的油料作物之一，已有五千年栽培歷史，通常被認為是由野生大豆（Glycine soja Sieb.et Zucc.）馴化而來［1］。野生大豆具有耐鹽堿、抗寒、抗病等許多優(yōu)良性狀［2，3］，是重要的野生資源植物，蘊藏著豐富的遺傳多樣性。野生大豆在黃河三角洲有大面積分布，墾利縣大汶流最多，常形成單一的野生大豆群落［4］。近年來，對野生大豆和栽培大豆的比較研究多見于有效成分比較［5］、種子貯藏蛋白研究［6］、生化及分子生物學分析［7、8］、抗逆性研究［9、10］，而黃河三角洲野生大豆與栽培大豆同工酶的比較分析尚未見報道。

同工酶是基因表達的產(chǎn)物，特異的基因表達產(chǎn)生特異的同工酶酶譜。目前同工酶已被廣泛的應用于植物系統(tǒng)演化研究、種質(zhì)資源的鑒定及親緣關(guān)系的研究等方面，都取得了良好的效果［11］。本實驗利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析東營市河口區(qū)的野生大豆和山東4個栽培大豆的過氧化物酶和酯酶同工酶酶譜特征，從而有助于進一步了解野生大豆與栽培大豆之間的親緣關(guān)系及進化，為野生大豆資源的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

野生大豆采自黃河三角洲東營市河口區(qū)濱海濕地，栽培大豆魯豆1、魯豆10、河豆12和中黃20均購自山東省農(nóng)業(yè)科學院。上述材料的種子播種于藥用植物園。所有材料經(jīng)山東中醫(yī)藥大學周鳳琴教授鑒定。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 種子萌發(fā)后，同一時間取其新鮮幼嫩葉片0.5g，加1mL提樣緩沖液和少量石英砂，在冰浴中研成勻漿，以2mL提取液分幾次洗入離心管，然后在4℃以8000r/min離心10min，取上清液，加入等量40%蔗糖溶液，搖勻，置于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 電泳 采用雙面垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，2種同工酶分離膠濃度均為7.5%，濃縮膠濃度均為3%。點樣30uL，0.1%溴酚藍作為前沿指示劑，pH 8.3Tris-甘氨酸緩沖液作為電極緩沖液。于4℃冰箱中220V電壓條件下電泳，待指示劑距玻璃板末端1.0cm處停止電泳。

1.2.3 染色 POD同工酶采用醋酸聯(lián)苯胺法（4mL聯(lián)苯胺貯液+18mL H2O+2滴 H2O2）染色，常溫下染色5min左右，水沖洗后照相。EST同工酶采用醋酸奈酯-堅牢藍RR鹽法（α-醋酸奈酯25mg，β-醋酸奈酯25mg，堅牢藍RR 50mg+少許丙酮+75mL pH 6.5的磷酸緩沖液）染色，常溫下染色25min左右，水沖洗后照相。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 依據(jù)電泳照片，記錄數(shù)據(jù)，求出相對遷移率和相似系數(shù)。酶帶的相對遷移率（Rf）＝酶帶的遷移距離/溴酚藍的遷移距離；同工酶酶譜間相似系數(shù)c＝2w/（a＋b），其中c為酶譜間相似系數(shù)，w為A和B兩個分類群相同的酶帶數(shù)，a為分類群A在酶譜中的酶帶數(shù)，b為分類群B在酶譜中的酶帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 POD同工酶

野生大豆與栽培大豆的過氧化物酶同工酶譜見圖1。

從圖1可知，野生大豆與栽培大豆的過氧化物同工酶譜型存在差異。栽培大豆共有9條酶帶，而野生大豆共有6條酶帶。根據(jù)泳動速率，酶譜可明顯分為2個部分，即慢區(qū)（S）和快區(qū)（F）。慢區(qū)Rf在0.021～0.277，快區(qū) Rf在 0.447～0.534（見表 1）。其中S1、S2為強帶，其余多為弱帶。S1、S2、S3、S5、S6、S7和F1、F2、F3為栽培大豆所有，S1、S2、S4、S6、S7和 F1為野大豆所有，即 S1、S2、S6、S7和 F1是大豆的特征譜帶，S4是野生大豆獨有的，而 S3、S5、F2、F3是栽培大豆獨有的譜帶。

表1 過氧化物酶帶的遷移率

圖1 野生大豆與栽培大豆過氧化物酶同工酶圖譜

2.2 EST同工酶

野生大豆與栽培大豆的酯酶同工酶譜見圖2。

表2 酯酶帶的遷移率

圖2 野生大豆與栽培大豆酯酶同工酶圖譜

從圖2可以看出，野生大豆與栽培大豆的酯酶同工酶譜也存在不同。栽培大豆在慢區(qū)和快區(qū)各有2條 帶 ， 分 別 為 S1、S2和 F1、F2。Rf值 分 別 為0.146，0.188，0.583和 0.646（見表 2），而野生大豆共有3條酶帶。S1、S2、F1為野生大豆和栽培大豆所共有的弱帶，F(xiàn)2是栽培大豆獨有的譜帶，而野生大豆沒有。

2.3 基于同工酶酶譜的相似系數(shù)分析

酶譜相似系數(shù)的大小表示品種親緣關(guān)系的遠近。本實驗中，經(jīng)分析可得，野生大豆與栽培大豆過氧化物酶同工酶酶譜的相似系數(shù)為0.667，酯酶同工酶酶譜的相似系數(shù)為0.714。從這兩種酶譜分析來看，野生大豆與栽培大豆之間的親緣關(guān)系比較近。

3 結(jié)論

野生大豆和栽培大豆不僅在植物外部形態(tài)和生境上存在差別，而且同工酶酶譜也存在明顯差別。在本次實驗中，野生大豆與栽培大豆過氧化物同工酶譜存在比較明顯的差異，酶帶分離效果較好。酯酶同工酶也存在區(qū)別，但效果不如過氧化物酶同工酶。過氧化物同工酶是由單基因決定的同工酶，它在一定程度上能較好的反映不同種源間的遺傳差異和親緣關(guān)系，而且利用其進行物種的輔助鑒定，是一種較為方便、有效的手段。因此過氧化物酶同工酶譜可以作為野生大豆和栽培大豆進化和類型鑒定的參考依據(jù)。但遺傳差異不僅僅體現(xiàn)在一兩種酶上，如果能同時對更多的同工酶進行分析，則更能全面的反映遺傳差異。

野生大豆與栽培大豆的過氧化物酶和酯酶同工酶譜雖然都存在差異，但更多的是相似性，二者之間的酶譜相似系數(shù)說明二者親緣關(guān)系較近，但也有各自的遺傳基礎。

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