王穎瑛

HCV是輸血后肝炎的重要病因，主要通過(guò)血液或血液制品傳播，HCV感染呈世界性分布，我國(guó)感染者約有4000萬(wàn)，為控制HCV經(jīng)血液傳播，要求對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行抗-HCV的檢測(cè)。常用的抗-HCV檢測(cè)試劑均采用間接酶聯(lián)免疫法，該方法中包被抗原的組成和質(zhì)量是關(guān)鍵因素。近年來(lái)對(duì)抗-HCV間接酶聯(lián)免疫法試劑單獨(dú)檢測(cè)陽(yáng)性，且在臨界值附近的樣本，用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法試劑檢測(cè)均為陰性，我們建立了雙抗原夾心ELISA方法［1］。改進(jìn)HCV的血清學(xué)診斷，取得良好的效果，現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 材料和方法

1.1 血清標(biāo)本 包括血液篩查陰性標(biāo)本420份，質(zhì)控標(biāo)本430份。

1.2 抗原的制備 嵌合表位抗原包括HCV-NS3-C-NS4-NS5，以包涵體形式表達(dá)，通過(guò)SP-SepharoseFF或Q-Sepharose FF離子交換層析進(jìn)行純化，將所收集的洗脫峰再用Sephadex G-50柱凝膠過(guò)濾，SDS-PAGE鑒定抗原蛋白。

1.3 試劑 吉比愛及Ortho丙肝病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑檢測(cè)。ChironRIBA確認(rèn)試劑。

1.4 雙抗原夾心法 用50mmol/L pH916碳酸鹽緩沖液(包被液)稀釋抗原至工作濃度。多肽抗原工作濃度為:結(jié)構(gòu)區(qū)多肽 15 Lg/ml，N S4 區(qū)多 0.5Lg/ml，N S5 區(qū)多肽 0.25 Lg/ml?；蚬こ瘫磉_(dá)抗原工作濃度C7和C11均為1 μg/ml。每孔加100 μl，置37℃保溫1 h后于4℃過(guò)夜。用含30%小牛血清PBST封閉，每孔加200 μl，置37℃保溫1 h。倒掉封閉液，每孔加50 μl樣品稀釋液，5 μl樣品，置37℃30 min。用PBST洗板5次。用棋盤滴定法選擇最適酶稀釋度，用稀釋液將酶標(biāo)記抗原稀釋至工作濃度。每孔加50 μl，置37℃保溫15 min。PBST洗板5次。每孔加底物緩沖液50 μl，顯色劑(TMB)50Ll，置37℃顯色10 min。每孔加2 mol/LH2SO 450 μl終止反應(yīng)，在Labsystem sM ult iskanM S型酶標(biāo)儀于450 nm測(cè)吸光度A值，標(biāo)本450 nm的A值大于或等于臨界值(Cutoff value)者為陽(yáng)性，反之為陰性。

2 結(jié)果

對(duì)240份HCV抗體陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，雙抗原夾心法檢測(cè)有3份標(biāo)本未檢出。3份樣本經(jīng)ChironRIBA確認(rèn)試劑檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性。敏感性較高99.85%，見表1。

表1 240份HCV抗體陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果

3 討論

HCV是輸血后肝炎的重要病因，主要通過(guò)血液或血液制品傳播，HCV感染呈世界性分布，我國(guó)感染者約有4000萬(wàn)，為控制HCV經(jīng)血液傳播，要求對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行抗-HCV的檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(EL ISA)檢測(cè)抗-HCV抗體是丙型肝炎病毒(HCV)感染診斷的主要方法。目前的抗-HCV酶聯(lián)免疫診斷試劑均采用二抗作酶結(jié)合物［2-3］，由于血清中IgG含量高，故少量的非特異吸附即可造成假陽(yáng)性結(jié)果，血清中類風(fēng)濕因子等也可能干擾檢測(cè)結(jié)果，且實(shí)驗(yàn)操作較繁瑣，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。檢測(cè)HCVRNA的PCR法雖可進(jìn)行早期診斷，但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且試劑昂貴，均較難普及。由于雙抗原夾心法不需要稀釋血清產(chǎn)品，不受類風(fēng)濕因子等的干擾，具有較高的特異性;可以同時(shí)檢出血清中各類抗體，特別是IgM類抗體，因此可以縮短從病毒感染到用ELISA法檢出抗體之間的“窗口期”。建立雙抗原夾心ELISA對(duì)于提高HCV感染診斷試劑的特異性和檢出率，縮短檢測(cè)時(shí)間，均有重要意義［4］。陽(yáng)性標(biāo)本的結(jié)果均為陰性，表明該試劑檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體試劑具有很好的特異性。HCV抗體陽(yáng)性的240份標(biāo)本有3份未檢出，這3份樣本使用國(guó)產(chǎn)吉比愛和Ortho間接丙肝病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑的檢測(cè)結(jié)果也均為陰性，經(jīng)Chiron RIBA確認(rèn)試劑檢測(cè)后，結(jié)果為陽(yáng)性，分析其原因可能為酶聯(lián)試劑所采用的HCV抗原為嵌合表達(dá)的抗原，而Chiron RIBA確認(rèn)試劑是將HCV抗原分別表達(dá)并固定于膜上，檢測(cè)針對(duì)4個(gè)抗原的HCV抗體，結(jié)果判斷與酶聯(lián)法不同，另外酶聯(lián)試劑與RIBA確認(rèn)試劑所用抗原也有一定的差異。雙抗原夾心丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑對(duì)所檢測(cè)的質(zhì)控標(biāo)本的檢測(cè)總符合率達(dá)99.85%，且敏感性和特異性均較好，有望用于臨床血液標(biāo)本的篩查。

［1］ColinC，LanoirD，TouzetS，et al.Sensitivityandspecificityofthird-generationhepatitisCvirusantibodydetectionassay:ananalysisoftheliterature.JournalofHepatitis，2001，8(1):87-95.

［2］宋曉國(guó).重組丙型肝炎病毒抗原的研究.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2001，25(2):91.

［3］謝立.丙型肝炎病毒檢測(cè)方法的研究進(jìn)展及其臨床意義.世界華人消化雜志，2005，13(7):884-886.

［4］王國(guó)華.雙抗原夾心與間接ELISA法檢測(cè)抗HCV對(duì)比研究.中國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2005，6(4):318-319.