劉志強(qiáng),張小鶯,黃 新,王光雷,努 爾,趙軍明,薄新文,王新華,鐘發(fā)剛

(1.新疆建設(shè)兵團(tuán)綿羊繁育基因工程重點實驗室,新疆石河子832000;2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,新疆烏魯木齊830000;3.德國柏林洪堡大學(xué)夏洛特醫(yī)學(xué)院藥理所,德國柏林10117)

犬細(xì)小病毒(canine parvovirus,CPV)是一種引起犬出血性腸炎或心肌炎的病毒[1]。歐洲首先在1976年和 1977年,在美國1978年都鑒定出存在CPV陽性血清.至1979年病例已蔓及世界各地[2-3]。1982年10月,我國報道在暴發(fā)傳染性出血性腹瀉的病犬糞便提取物中,發(fā)現(xiàn)細(xì)小病毒顆粒,其大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)具有典型的細(xì)小病毒特征,從而首次證實該病在我國的存在[4-5]。隨后,在我國各地陸續(xù)有本病發(fā)生的報道。近年來隨著城市寵物熱的興起,該病廣泛的傳播蔓延。據(jù)石河子市獸醫(yī)防疫站初步統(tǒng)計,在犬的各種傳染病中,犬細(xì)小病毒性腸炎發(fā)病率、死亡率均為最高,為當(dāng)前犬的主要傳染病之一。本實驗室從病死犬的內(nèi)臟中分離到1株犬細(xì)小病毒,初步命名為CPV-SHZ毒株。

1 材料與方法

1.1 病料及細(xì)胞 分別采集病死犬的心、肝、脾、小腸及內(nèi)容物。CPV陽性血清(細(xì)小病毒疫苗免疫家兔制備)、F81貓腎傳代細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)。紅細(xì)胞:采集健康豬抗凝的血液,洗滌后配成0.5%紅細(xì)胞懸液備用。

1.2 主要試劑 RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Gibco公司),犢牛血清(蘭州民海生物工程有限公司),胰蛋白酶(Amresco),DNA Marker Gene Ruler 100bp DNA Ladder plus、PCR(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),T aKaRa Ex Taq酶[寶生物工程(大連)有限公司]。PCR回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。培養(yǎng)液為10%犢牛血清RPMI～1640,維持液為2%犢牛血清RPMI-1640,消化液為0.25%胰蛋白酶EDTA。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)已發(fā)表CPV的VP2基因序列利用Primer 5.0軟件設(shè)計了1對引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

上游引物(C1):5′-GGCAAGCT TATGAGTGATGGAGCAGTTC-3′

下游引物(C2):5′-CGCGTCGACTATGT TAATATAAT TT TCT-3′

1.4 病毒分離 采用同步接種法,同步接種F81貓腎細(xì)胞,24 h后將生長液棄去換上維持液,逐日觀察,待出現(xiàn)明顯的CPE(達(dá)80%)收毒,細(xì)胞長滿單層未出現(xiàn)CPE繼續(xù)傳代,整個過程設(shè)有對照。收獲病毒細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次,4 000 r/min離心30 min,上清液用氯仿處理2次,水相加入聚乙二醇-6 000(PEG),使其終濃度達(dá) 12%,4℃過夜,10 000 r/min離心30 min,沉淀用PBS稀釋,打碎沉淀塊,再次氯仿處理,水相即為病毒濃縮液。

1.5 病毒純化 病毒濃縮液用Sepharose-4B柱層析,用 0.01 moL/L PBS(pH值 7.2)平衡并洗脫[6-7],分管收集,用電鏡和SDS-PAGE電泳檢測洗脫液中的病毒。

1.6 病毒鑒定

1.6.1 HA及HI試驗 按文獻(xiàn)[8-9]方法進(jìn)行。1.6.2 病毒毒力測定 F81細(xì)胞在96孔板上滴定病毒的TCID50。并用5-IUDR處理待鑒定病毒進(jìn)行核酸型鑒定。

1.6.3 電鏡觀察 按文獻(xiàn)[1]方法進(jìn)行。

1.6.4 VP2基因的擴(kuò)增 取病毒濃縮液50 μ L隔水煮10 min后離心,上清即為模板。

PCR擴(kuò)增體系:50 μ LPCR反應(yīng)體系如下:(引物濃度 50 pmol/μ L),ddH2O(29.5 μ L),10 ×PCR Buffer(5 μ L),dNTP(8 μ L),模 板 (5 μ L),C1(1 μ L),C2(1 μ L),Taq 酶(0.5 μ L),PCR 反 應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,94℃1 min,54℃1 min,72℃1.5 min,順序30個循環(huán),72℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束,取少量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果,陽性產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.5 VP2基因的序列分析 應(yīng)用回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)回收PCR產(chǎn)物,將回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體上轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,37℃培養(yǎng)18～24 h,藍(lán)白斑篩選陽性菌接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL Amp+),37℃培養(yǎng)過夜,分裝送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用序列分析軟件進(jìn)行比較。

1.6.6 動物回歸試驗 選取兩月齡、未注射犬細(xì)小病毒疫苗易感犬5只,2只1組,分別皮下注射和口服途徑接種2 mL CPV細(xì)胞培養(yǎng)物,余下1只隔離飼養(yǎng)設(shè)為對照,攻毒3 d后,每日收集犬腸內(nèi)容物作PCR檢測,逐日觀察各項生理指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離結(jié)果 正常的F81細(xì)胞為貼壁生長、均質(zhì)透明的不規(guī)則多邊形(見圖1)。接毒F81細(xì)胞,盲傳3～4代可見特征病變:脫落、變形、游離、拉網(wǎng)(見圖2)。

圖1 正常的F81細(xì)胞

2.2 病毒純化結(jié)果 病毒濃縮液經(jīng)Sephrose-4B柱層析后,出現(xiàn) 2個洗脫峰,經(jīng) ELISA和 SDSPAGE電泳測定病毒抗原主要在第二峰,可見兩條清晰的條帶:76 ku的VP1,64 ku的VP2(見圖3),與文獻(xiàn)報道相[10]符合。免疫電鏡觀察結(jié)果(見圖4),可見病毒粒子呈圓形或六邊形,直徑為20～24 nm,多數(shù)為實心,少數(shù)為空心,表面無囊膜,病毒粒子呈聚集狀態(tài)。

2.3 病毒鑒定結(jié)果

2.3.1 HA和HI試驗結(jié)果 病毒培養(yǎng)物能凝集豬的紅細(xì)胞,其效價高于2×109,用已知CPV陽性血清可規(guī)律性的抑制其血凝作用。

2.3.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR擴(kuò)增在1.7 kb處看到1條明亮的條帶,與所設(shè)計目的條帶大小相符合。2.3.3 病毒毒力測定結(jié)果 F81細(xì)胞測定CPVSHZ的TCID50為10-6.0,較加 5-IUDR處理(10-4.0)高3個對數(shù)。說明病毒代謝可被5-IUDR所抑制,其核酸類型屬于DNA型。

2.3.4 序列分析結(jié)果 將測定核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與 CPV參考株 V154、LCPV-V204、LCPV-V139、LCPV-V203進(jìn)行比較分析。從結(jié)果可看出此次分離到的CPV為2a型。但是其VP2的第970、971、1 694位氨基酸分別發(fā)生了A→T、T→A、G→A的替換。其第424位和564位氨基酸發(fā)生I→V和S→N的替換。

2.4 動物回歸試驗 兩種途徑接種試驗動物犬,分別在第3天和第5天出現(xiàn)體溫升高、厭食、精神沉郁、灰白色粥狀樣糞便等臨床癥狀。病犬白細(xì)胞數(shù)減少到6 400個/mm3(未接種前試驗犬的白細(xì)胞數(shù)為12 000～13 000個/mm3)左右。發(fā)病后7 d死亡,剖檢可見尸體消瘦,嚴(yán)重脫水,皮膚干燥,有碎屑。可視黏膜蒼白,眼球凹陷;胃內(nèi)空虛,胃底部黏膜出血;空腸及回腸黏膜充血,腸腔擴(kuò)張;腸內(nèi)容物水樣暗紅色,有特殊的臭味,腸系膜淋巴結(jié)腫脹,腸絨毛明顯萎縮,黏膜脫落。

3 討論

3.1 病毒分離 用F81貓腎傳代細(xì)胞增殖CPV出現(xiàn)了明顯的CPE,這與前人的研究結(jié)果[11]相符合。為提高病毒的分離率,在糞便處理時可使用氯仿抽提,并按細(xì)胞培養(yǎng)液的1/20進(jìn)行接種。由于CPV的DNA在復(fù)制時需要處于有絲分裂過程中宿主細(xì)胞某些機(jī)能的輔助[12],采取細(xì)胞培養(yǎng)同步接種病毒,能達(dá)到使病毒良好增殖的目的。

3.2 病毒鑒定 HA檢測結(jié)果與犬細(xì)小病毒特性相符,并且能被CPV陽性血清規(guī)律性抑制,在日常應(yīng)用中能經(jīng)濟(jì)、簡便、快捷、可靠的對CPV作出鑒定;免疫電鏡觀察到大小均一、成聚集狀態(tài)的病毒粒子,從形態(tài)上對CPV作以鑒定;根據(jù)犬細(xì)小病毒的基因組設(shè)計特異性寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測到相應(yīng)的目的條帶。測序得到犬細(xì)小病毒VP2全基因組序列。序列比較分析,與CPV參考株同源性在99%以上。在分子水平上對CPV作以鑒定。

3.3 病毒純化 用Sephrose-4B柱層析純化CPV,具有操作簡單、快速的特點,可以處理大量的病毒細(xì)胞培養(yǎng)物,純化的病毒可用作制備診斷抗原和疫苗。3.4 序列比對分析 1978年CPV被發(fā)現(xiàn)至今,先后出現(xiàn)了 5個突變株亞型,即 CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)[13]。Parrish C R等[14]在研究CPV的進(jìn)化時發(fā)現(xiàn),CPV-2a是在1981年取代了自 1978年以來的CPV-2型,而CPV-2b抗原類型在1986年發(fā)現(xiàn)。CPV-2到CPV-2a、CPV-2b,只有幾個堿基發(fā)生了變異,抗原則發(fā)生變異。CPV-2a(2b)VP2的87位、300位氨基酸和305位氨基酸與 CPV-2不同。CPV-2a和CPV-2b只有426位氨基酸不同,426D是CPV-2b特有的[15]。在CPV-2a和CPV-2b的VP2的第300位氨基酸發(fā)生G到D替換,分別命名為 CPV-2c(a)和 CPV-2c(b)[16]。本試驗克隆了CPV-VP2基因的1 755 bp,從起始密碼子到1 755 bp處,參照分型標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)為CPV-2a型,這與文獻(xiàn)報道目前在我國流行的毒株以CPV-2a占主要地位相符合,這與CPV在意大利、澳大利亞和英國的流行情況相似。分離株在324、424位氨基酸與564位氨基酸突變,這種變異還未見文獻(xiàn)報道,該位氨基酸變化是否引起生物學(xué)特性改變還有待進(jìn)一步研究。

本試驗通過新疆石河子分離株(CPV-SHZ)VP2基因的序列分析,為我國CPV分子流行病學(xué)調(diào)查提供了一定的參考依據(jù),并為進(jìn)一步探討CPV的抗原變異及研制CPV基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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