李金龍,國(guó) 琳,劉曉瑛,張久麗,3,孫 剛,徐世文

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱150030;2.浙江省余姚市畜牧獸醫(yī)局,浙江余姚315400;3.黑龍江畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院,黑龍江 雙城150100;4.黑龍江省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,黑龍江哈爾濱150090)

雞馬立克病(MD)是世界上第一個(gè)能用疫苗成功預(yù)防的腫瘤性疾病,因此在腫瘤發(fā)生和抗腫瘤治療方面的研究中,MD是一種理想的腫瘤模型[1]。三氧化二砷(As2O3)主要是通過(guò)抑制雞MD腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡起抗腫瘤作用[2-3],近年人們又發(fā)現(xiàn)As2O3可以通過(guò)抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮抗腫瘤的效果。因此,研究腫瘤血管形成為探尋肝臟腫瘤的治療提供了新策略,但關(guān)于As2O3對(duì)MDV誘導(dǎo)的雞肝臟腫瘤中血管生長(zhǎng)影響的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在揭示MD雞肝臟腫瘤中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)情況和As2O3對(duì)其影響,探討As2O3抑制MD雞肝臟腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與處理 1日齡伊莎公雞500只(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)孵化場(chǎng)),隨機(jī)分為對(duì)照組100只、攻毒組與攻毒加砷組各200只,按常規(guī)進(jìn)行免疫接種(攻毒組與攻毒加砷組不接種馬立克疫苗),隔離飼養(yǎng),自由采食。對(duì)照組,常規(guī)飼養(yǎng);攻毒組與攻毒加砷組在第1天腹腔注射用 Hank's液10倍稀釋的SPF雛雞復(fù)壯的MDV京-1株(由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所劉長(zhǎng)軍研究員惠贈(zèng))新鮮血毒,劑量為0.2 mL/羽。飼養(yǎng)30 d后,攻毒加砷組,每?jī)扇崭骨蛔⑸銩s2O33.0 mg/kg體重,對(duì)照組和攻毒組注射等量生理鹽水,連續(xù)觀察試驗(yàn)組雞的臨床表現(xiàn)并記錄。分別于第35、40、45天剖殺試驗(yàn)雞,進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 主要試劑 As2O3注射液(1 mg/mL)由本研究室制備,rTaq DNA聚合酶等PCR反應(yīng)試劑均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,T rizol試劑盒、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 臨床觀察及血管組織病理學(xué)檢查 記錄各試驗(yàn)組雞的臨床癥狀,觀察病理剖檢變化,按常規(guī)法取對(duì)照組肝臟和試驗(yàn)組肝臟腫瘤組織,固定,制片,H.E.染色觀察。

1.4 雞肝臟及腫瘤組織中血管生長(zhǎng)相關(guān)因子VEGF、KDR及bFGF mRNA表達(dá)的檢測(cè) 根據(jù)GenBank上VEGF基因序列(序列號(hào)AB011078)、KDR基因序列(序列號(hào)AY382882)、bFGF基因序列(序列號(hào)NM205433)與β-actin基因序列(序列號(hào)NM205518),應(yīng)用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。VEGF引物(PCR產(chǎn)物 長(zhǎng) 度 458bp)上 游:5′-GATGAGATGTGCGGGT TGC-3′, 下 游 :5′-AAATCAGGCTCCAGAAACAG-3′;KDR引物(PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度428 bp)上 游:5′-GAGTCATAGGCAACGACAC-3′,下游:5′-CAGCTCAACTTGGTAGTG-3′;bFGF 引 物(PCR 產(chǎn) 物 長(zhǎng) 度 233bp)上 游:5′-TTCAAGCAGAAGAAAGAGGAG-3′, 下 游:5′-AGGTCCAGTTTTTGGTCCG-3′;β-actin 引物(PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度282 bp)上游:5′-ACG TCGCACTGGATT TCGAG-3′下游 :5′-TGTCAGCAATGCCAGGGTAC-3′

應(yīng)用Trizol試劑盒提取肝臟及腫瘤組織總RNA,并測(cè)定 RNA濃度及純度。取總 RNA 5.0 μ g,以加寡脫氧胸苷(Oligo(dT))為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ L,進(jìn)行 50 μ L 反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:預(yù)變性95℃5 min,變性95℃1 min,退火 58.5℃(VEGF)、54℃(KDR、bFGF與β-actin)、45s,延伸 72℃1 min,30個(gè)循環(huán),72℃終延伸 7 min。分別以 VEGF、KDR及bFGF基因與β-actin基因的PCR產(chǎn)物的灰度比值來(lái)表示基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SAS軟件與Microsoft Excel 2 000對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并作圖。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察及血管組織病理學(xué)變化 對(duì)照組雞無(wú)異常。攻毒組雞表現(xiàn)出MD典型癥狀,如“劈叉”現(xiàn)象,剖檢可見(jiàn)肝臟表面有灰白色粟粒至綠豆大不等的病灶(見(jiàn)圖1,圖2)。攻毒組加砷組雞注射As2O3后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)癥狀逐漸減輕,剖檢可見(jiàn)肝臟腫瘤出現(xiàn)明顯減少,生成的腫瘤也有明顯減小。

組織學(xué)檢查對(duì)照組肝臟結(jié)構(gòu)正常。攻毒組病雞肝臟小葉間結(jié)締組織中見(jiàn)界限模糊的結(jié)節(jié)性增生,其周?chē)茇S富,有大量血管上皮細(xì)胞,肝竇中有部分的彌散性浸潤(rùn)(見(jiàn)圖3)。攻毒組加砷組病雞肝臟中可見(jiàn)灶狀瘤細(xì)胞團(tuán),周?chē)?xì)胞有空泡變,匯管區(qū)擴(kuò)大,周?chē)軘?shù)量明顯減少,血管上皮細(xì)胞脫落、變性,個(gè)別出現(xiàn)細(xì)胞壞死,周?chē)Y(jié)締組織有纖維化(見(jiàn)圖4)。

2.2 雞肝臟及腫瘤組織中VEGF與KDR mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。

由表1可知,攻毒加砷組肝臟腫瘤組織內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,與同一時(shí)間段對(duì)照組比較,各組間均差異極顯著(P＜0.01),與同一時(shí)間段攻毒組比較,45 d組差異極顯著(P＜0.01)。攻毒加砷組肝臟腫瘤內(nèi)KDR mRNA的表達(dá)水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,與同一時(shí)間段對(duì)照組比較,35 d組間差異極顯著(P＜0.01);與同一時(shí)間段攻毒組比較,40 d和45 d組差異極顯著(P＜0.01);攻毒加砷組間比較,35 d與40 d和45 d組間差異極顯著(P＜0.01)。

表1 雞肝臟及腫瘤內(nèi)VEGF與KDR mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果

2.3 雞肝臟及腫瘤組織中bFGF mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。

由表 2可知,攻毒加砷組肝臟腫瘤內(nèi) bFGF mRNA的表達(dá)水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,與同一時(shí)間段對(duì)照組比較,各組間差異極顯著(P＜0.01);與同一時(shí)間段攻毒組相比,40 d和45 d組間差異極顯著(P＜0.01);攻毒加砷組間比較,各組間差異極顯著(P＜0.01)。

表2 雞肝臟及腫瘤內(nèi)bFGFmRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果[IOD(bFGF)/IOD(β-actin)]

3 討論

研究表明VEGF及其受體(VEGFR)在肝臟腫瘤組織中較正常肝組織呈過(guò)高表達(dá),與肝臟腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及治療密切相關(guān)[4]。As2O3能夠抑制乳腺腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA及VEGF蛋白的表達(dá),且隨 As2O3濃度的增加其抑制作用更明顯[5]。Roboz G J等[6]證實(shí)As2O3可直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和白血病細(xì)胞凋亡,使VEGF表達(dá)減少,抑制腫瘤的新生血管生成。bFGF是最重要的多肽類生長(zhǎng)因子之一,作為一種強(qiáng)有力的促血管生成劑,具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為血管生成表型的能力,其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Woo S H等[7]研究發(fā)現(xiàn),As2O3能夠明顯的抑制bFGF、VEGF刺激的人臍靜脈上皮細(xì)胞增殖,并有劑量依賴性。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,MD病雞肝臟腫瘤內(nèi)VEGF、KDR及bFGF mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常肝臟組織,As2O3能夠下調(diào)腫瘤組織內(nèi)VEGF、KDR與bFGF mRNA的表達(dá)水平,并呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng);而MD病雞腹腔注射As2O3后,臨床癥狀減輕,肝臟腫瘤數(shù)量和大小明顯較少,腫瘤組織周?chē)軘?shù)量明顯減少,血管上皮細(xì)胞脫落、變性,個(gè)別出現(xiàn)壞死。揭示As2O3能夠通過(guò)下調(diào)肝臟腫瘤組織中VEGF、KDR與bFGF mRNA的表達(dá)水平,破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為血管生成表型,從而直接抑制腫瘤血管的新生,減少腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給,對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)起到控制作用,這是As2O3抗腫瘤作用機(jī)制之一。

[1]Burgess S C,Young J R,Baaten B J,et al.M arek′s disease is a natural model for lymphomas overexpressing Hodgkin′s disease antigen(CD30)[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(38):13879-13884.

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