胡樂琴,柳俊秀,王 權(quán),田曉玲,何培民

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海南匯201306; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲病研究所,上海閔行200232)

大田軟海綿酸(OA)是腹瀉性貝類毒素(DSP)的主要成分,其藻源分布廣,在我國(guó)引發(fā)的中毒事件最多,危害最大[1],已被列為最重要的食物中毒之一,而我國(guó)迄今為止尚沒有一種較合適于現(xiàn)場(chǎng)使用的軟海綿酸檢測(cè)方法,因此研制我國(guó)自己的檢測(cè)軟海綿酸的方法已成為當(dāng)務(wù)之急。與其他檢測(cè)方法相比,酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性高和檢測(cè)準(zhǔn)確快速的優(yōu)點(diǎn)[2],在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)上具有開發(fā)前景,近年來在赤潮藻毒素快速檢測(cè)方面得到重視和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)室在成功制備高效價(jià)OA單克隆抗體的基礎(chǔ)上,初步建立了檢測(cè)OA的間接競(jìng)爭(zhēng)酶免疫學(xué)檢測(cè)方法,為研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的相關(guān)檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 雜交瘤細(xì)胞株由本課題組研制和凍存;BALB/c健康小鼠由中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心研究所提供。其他試劑國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 OA單克隆抗體制備 按常規(guī)小鼠腹水法[3]制備單克隆抗體。

1.3 包被抗原(2.5 mg/L)的制備 按文獻(xiàn)[4]的方法制備。

1.4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立

1.4.1 抗原、抗體最佳稀釋濃度的確定 在96孔ELISA板上按常規(guī)方法進(jìn)行。檢測(cè)抗原用包被緩沖液pH 9.6,0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋為1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000四個(gè)濃度 ,每濃度做3個(gè)重復(fù);OA抗體用含5%牛血清的稀釋液稀釋成1∶5 000、1∶10 000∶1∶15 000、1∶20 000、1∶4 0000、1∶6 000、1∶8 000七個(gè)濃度梯度;封閉液為1%明膠;酶標(biāo)二抗羊抗鼠 IgG濃度為1∶5 000;顯色液為 TMB;終止液為 2 mol/L H2SO4。在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450值。

1.4.2 一抗、二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 根據(jù)以上試驗(yàn)選取最佳的抗原、抗體稀釋度包板,將一抗的保溫時(shí)間設(shè)為 30、60、90、120 min 4 組 ,每組 3 個(gè)平行,二抗反應(yīng)時(shí)間固定為60min。測(cè)定OD450值,選擇最佳一抗反應(yīng)時(shí)間。固定此最佳的一抗反應(yīng)時(shí)間,將二抗反應(yīng)時(shí)間設(shè)為 30、60、90、120 min 4組,每組3個(gè)平行,重復(fù)以上試驗(yàn),根據(jù)OD450值選擇最佳二抗反應(yīng)時(shí)間。

1.4.3 OA溶解液甲醇含量對(duì)id-ELISA的影響一抗和甲醇同時(shí)加入,每孔甲醇終濃度設(shè)置為0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%等11個(gè)濃度梯度,測(cè)OD450值。根據(jù)OD450值的大小進(jìn)行判定甲醇對(duì)免疫反應(yīng)的影響。

甲醇溶解OA后和一抗同時(shí)加入,OA濃度為1∶8 000;每孔甲醇的終濃度為20%、30%、40% 。另設(shè)一組不加OA的作為陰性對(duì)照組。測(cè)OD450值,計(jì)算出抑制率。

1.5 OA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得 OA終濃度稀釋為200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL 、12.5 ng/mL 、6.25 ng/mL 、5 ng/mL 、2.5 ng/mL 、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL 、0.3125 ng/mL 、0.156 ng/mL、0.078 ng/mL 13個(gè)濃度梯度,按最佳的稀釋度和反應(yīng)時(shí)間,用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)OD450值,以抑制率(P/N)為縱坐標(biāo),以log(10×OA濃度)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.6 樣品模擬提取與加標(biāo)回收 方法參見(Tagmouti-Talha F,2000)[5]。將貝類樣品洗凈、勻漿,稱取5 g于離心管,加入弱酸性的甲醇溶液,隨后加入一定量的OA標(biāo)準(zhǔn)液。3 500 r/min離心10 min,取上清。將上清分裝兩管,分別加入甲醇和正己烷,渦旋混勻,靜止分層。棄正己烷層,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干,加少量甲醇溶解壁上附著物,再蒸干。最后用100 μ L 甲醇溶解殘余物 ,再加 900 μ L PBST,混勻 。提取物進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

OA的實(shí)測(cè)含量(ng/mL)是根據(jù)酶標(biāo)板上測(cè)得OD450值后由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得log(10×OA濃度),再通過反對(duì)數(shù)計(jì)算得出。

1.7 精密度測(cè)定 取一定量樣品,平行提取,同時(shí)檢測(cè),求得實(shí)測(cè)濃度。

1.8 計(jì)算 抑制率P/N(%)=(A0-A)/A0×100%(A為吸光值);回收率=實(shí)測(cè)濃度/添加濃度×100%;精密度=變異系數(shù)=SD/X(X為實(shí)測(cè)濃度的平均值,SD為標(biāo)準(zhǔn)差)。

2 結(jié)果

2.1 抗原和單抗最適工作濃度的確定 按試驗(yàn)方法測(cè)定OD450值,選OD450值為2.0左右的確定為抗原抗體最適工作濃度。結(jié)果顯示,檢測(cè)抗原OAOVA按1:2 000稀釋即濃度為 1.25 μ g/L,單抗稀釋度為1:20 000時(shí),既能保證免疫反應(yīng)效果好,又使得抗原抗體用量最少。

2.2 甲醇含量對(duì)id-ELISA的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明,未加OA時(shí),OD450隨著一抗中甲醇濃度的提高而遞增,當(dāng)甲醇終濃度高于10%時(shí),這種遞增趨勢(shì)更明顯。當(dāng)OA與甲醇同時(shí)加入時(shí),甲醇濃度的增加會(huì)降低OA免疫反應(yīng)的抑制率(如圖1)。因此,樣品提取時(shí),為了保證OA全部萃取出來,可先用少量甲醇將其溶解,再用緩沖溶液PBST將甲醇含量稀釋到10%以下,而在ELISA檢測(cè)時(shí),可以直接用PBST稀釋OA標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液,將甲醇對(duì)檢測(cè)的干擾減少到最低值。

圖1 甲醇含量對(duì)抑制率的影響 (加OA)

2.3 抗體反應(yīng)時(shí)間對(duì)id-ELISA的影響 從試驗(yàn)結(jié)果得知,未加OA時(shí),吸光值OD450會(huì)隨著抗體反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,考慮到要節(jié)省檢測(cè)時(shí)間,因而選用抗體反應(yīng)時(shí)間都為60 min和90 min進(jìn)行OA間接競(jìng)爭(zhēng)免疫抑制反應(yīng),結(jié)果如圖2所示,表明一抗和酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時(shí)間均為60 min時(shí),其抑制率較高,即抗體對(duì)包被抗原結(jié)合反應(yīng)的抑制效果最好。

2.4 OA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立 用碳酸鹽緩沖液將OA-OVA包被原稀釋為1∶2 000,包被96孔酶標(biāo)板,每孔 100 μ L,4℃過夜;棄殘液,洗板;用1%明膠封板,每孔 150 μ L,37℃下保溫 2 h;棄封閉液,洗板,用PBST將OA標(biāo)準(zhǔn)溶液或貝類萃取液稀釋為系列濃度,分別與等體積的單抗混勻,單抗終稀釋度為1∶20 000,每孔加入100 μ L,37℃下保溫1 h;棄去殘液,洗板,加入酶標(biāo)二抗,按產(chǎn)品說明書推薦的濃度 1∶5 000進(jìn)行稀釋,每孔100 μ L,37℃下保溫1 h;洗板3次,每孔加入100 μ L顯色液,室溫下反應(yīng)10～15 min,加入終止液,測(cè)OD450值。

圖2 抗體反應(yīng)時(shí)間對(duì)id-ELISA的影響

2.5 OA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得 試驗(yàn)結(jié)果如圖抑制率曲線(圖3)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。抑制率曲線呈“S”分布。當(dāng)OA的濃度低于0.3125 ng/mL時(shí),抑制率幾乎降到0,而高于50 ng/mL時(shí),OA對(duì)免疫反應(yīng)的抑制效果幾乎一樣,因此,OA濃度的有效檢測(cè)范圍在0.3125 ng/mL～50 ng/mL之間,在此范圍內(nèi)繪制OA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為y=0.392x-0.054,R2=0.955,有效線性檢測(cè)范圍為0.3125 ng/mL～50 ng/mL,IC50為2.59 ng/mL,檢測(cè)限為0.45 ng/mL。

2.6 OA加標(biāo)回收率與樣品精密度測(cè)定結(jié)果 在OA陰性的貝類樣品中分別加入12.5、25、125、500 ng/mL的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液,提取后用本試驗(yàn)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行檢測(cè),其回收率與精密度結(jié)果見表1。此方法平均回收率為55.85%,變異系數(shù)為3.03%～8.94%,說明該方法重復(fù)性良好,無(wú)需在樣品檢測(cè)時(shí)做更多平行樣。既節(jié)約了試劑成本,又節(jié)約了人力和時(shí)間的消耗。

3 討論

目前,國(guó)內(nèi)檢測(cè)OA的方法主要是小鼠法、高效液相色譜法(HPLC)和免疫檢測(cè)技術(shù)(ELISA)。小鼠法簡(jiǎn)便易行,但缺點(diǎn)是受干擾較大,數(shù)據(jù)不精確[6];HPLC法可準(zhǔn)確分析毒素的含量和種類,檢測(cè)限可低至ng/g,但樣品前處理過程復(fù)雜,儀器昂貴,需要專門人員;ELISA法比HPLC法樣品前處理簡(jiǎn)單得多,特異性好,無(wú)需純化濃縮。另外,ELISA法比HPLC法操作時(shí)間短,一次可處理大量樣品,而且,ELISA法比HPLC法投資小,適合基層單位使用,因此呈現(xiàn)出了較好的應(yīng)用前景,受到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。

表1 回收率與精密度測(cè)定結(jié)果

國(guó)外多家公司已開發(fā)研制出了檢測(cè)OA的試劑盒,如日本 Panapharm Laboratories公司生產(chǎn)的OA ELISA檢測(cè)試劑盒檢出限是10 ng/mL[7],美國(guó)柏爾BIOO公司也生產(chǎn)出了OA ELISA檢測(cè)試劑盒,但由于價(jià)格昂貴,遠(yuǎn)不適用于我國(guó)商檢部門的大量應(yīng)用。近幾年國(guó)內(nèi)外均開展了許多關(guān)于OA毒素的檢測(cè)研究,如盧士英[8],用ELISA法檢測(cè)OA的線性范圍為0.4 ng/mL～25 ng/mL,而本研究的線性檢測(cè)范圍為0.3125 ng/mL～50 ng/mL,比其檢測(cè)范圍要廣;李愛峰[9]利用蛋白磷酸酶活力抑制法檢測(cè)OA的最低濃度為0.6 ng/mL,Takashi U等建立的ELISA檢測(cè)腹瀉性貝毒方法檢出限為10 ng/mL[2],而本研究的最低檢測(cè)限是0.45 ng/mL,比前者都低;Maurice V L等[10]運(yùn)用OA的快速檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)其 IC50為 6.5 ng/mL,本研究的IC50為2.59 ng/mL,說明本研究的靈敏度更低。

因此,本試驗(yàn)研究結(jié)果證明,該ELISA方法工作范圍更寬,靈敏度較低,檢測(cè)限也偏低,試驗(yàn)重復(fù)性較高。但樣品回收率與國(guó)內(nèi)外存在較大差距,今后需在樣品模擬提取上進(jìn)一步摸索與完善。

[1]Suganuma M,Fujuki H,Suguri H,et al.Okadaic acid:a new non-12-O-tetradecanoyl phorbol acetate type tumour promoter[J].Proc natn Acad Sci USA,1988,85:1768-1773.

[2]劉仁沿,梁玉波,張芳,等.中國(guó)沿海貝類腹瀉性貝毒的酶聯(lián)免疫分析方法[J].大連海事大學(xué)學(xué)報(bào),2008,34(2):33-36.

[3]李自剛,王慧杰.生物檢測(cè)技術(shù)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2007.

[4]Nuria M Llamas,Linda Stewart,Terry Fodey,et al.Development of a novel immunobiosensor method for the rapid detection of okadaic acid contamination in shellfish extracts[J].Anal Bioanal Chem,2007,389:581-587.

[5]Tagmouti-Talha F,Moutaouakkil A,T aib N,et al.Detection of Paralytic and Diarrhetic Shellfish Toxins in Moroccan Cockles(Acanthocardia tuberculata)[J].Bull Environ Contam Toxicol,2000,65:707-716.

[6]柳俊秀,陳桃英,何培民,等.微小亞歷山大藻麻痹性貝類毒素的檢測(cè)[J].生物技術(shù)通報(bào),2008,5:181-184.

[7]Vale P,Sampay o MAM.Comparison between HP LC and a commercial immunoassay kit for detection of okadaic acid and esters in Portuguese bivalves[J].Toxicon,1999,37:1565-1577.

[8]盧士英,周玉,李巖松,等.大田軟海綿酸單克隆抗體 ELISA檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,27(3):336-411.

[9]李愛峰,于仁成,李鈞,等.利用蛋白磷酸酶活力抑制法檢測(cè)牡蠣體內(nèi)的腹瀉性貝毒[J].分析化學(xué)研究報(bào)告,2006,34(3):283-287.

[10]Maurice V L,Joanne F J,Dorothy J E,etal.First report of a new rapid assay for diarrhetic shellfish poisoning toxins[J].Harmful Algae,2006,5:74-78.