侯玉杰,時(shí)成龍,相文華,郭 巍,李紅梅,趙立平,胡 蘭

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧沈陽(yáng)110161;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,黑龍江哈爾濱150001)

馬病毒性動(dòng)脈炎(equine virus arteritis,EVA)是一種由馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)引起的,在馬屬動(dòng)物之間通過(guò)呼吸道或生殖器官傳播的傳染病。國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(International Committee on the Taxonomy of Viruses,ICTV)于2006年第八次分類(lèi)報(bào)告[1]將EAV歸屬于套式病毒目動(dòng)脈炎病毒科的成員,與乳酸脫氫酶增高癥病毒(lactic dehydrogenase virus,LDV)、豬呼吸與繁殖綜合征病毒(porcine respiratory and reproductive syndrome virus,PRRSV)、猿出血熱病毒(simian hemorrhagic fever virus,SHFV)同科。EAV是線性單股正鏈RNA病毒,含有7個(gè)開(kāi)放閱讀框,編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白:大囊膜蛋白GP5、囊膜蛋白M 、核衣殼蛋白N和小囊膜蛋白Gs。其中GP5蛋白是馬動(dòng)脈炎病毒最主要的保護(hù)性抗原[2],其55-98位氨基酸區(qū)域具有較強(qiáng)的免疫原性[3]。

世界許多國(guó)家的馬群中均有本病存在[4],我國(guó)也存在此病,但還未分離到病毒。典型病例多為下列不同癥狀的不同組合:發(fā)熱、精神沉郁、食欲減退、墜積性水腫、結(jié)膜炎及孕馬流產(chǎn)等為特征,對(duì)馬產(chǎn)業(yè)能引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,在世界各國(guó)的馬匹進(jìn)出口檢疫中十分重視。OIE將此病列為二類(lèi)傳染病,是馬匹的重大必檢疫病。本試驗(yàn)克隆EAV GP5蛋白主要抗原域編碼基因并進(jìn)行原核表達(dá)及純化,并對(duì)重組的pGP5的免疫學(xué)活性進(jìn)行了研究,為制備抗EAV單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞及載體 EVA標(biāo)準(zhǔn)Bucyrus株、E.coli宿主菌DH5α和BL21(DE3)菌株、原核表達(dá)載體pET-30a質(zhì)粒由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.2 工具酶主要試劑 病毒RNA提取試劑盒購(gòu)自上海華舜公司,核酸回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega。工具酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。MEM培養(yǎng)基和小牛血清購(gòu)自Gibco公司。FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自中衫金橋公司。His-Tag Monoclonal Antibody、BCA Protein Assay Kit為Novagen公司產(chǎn)品。Anti-Mouse IgG 、Anti-Rabbit IgG、OPD(鄰苯二胺)、IPTG均購(gòu)自Sigma公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank登陸的 EAV Bucyrus(NC-002532.2)基因序列,應(yīng)用 DNAStar軟件分析GP5蛋白抗原性,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,目標(biāo)擴(kuò)增基因?yàn)镋AV GP5蛋白主要抗原域編碼基因,對(duì)應(yīng)EAV GP5 79～330 bp。

GF:5′-GGA TCC CGC T TC ACA GAC T TC ACC-3′(BamH Ⅰ);

GR:5′-AAG CT T CTA AAA AGG GGG CAT GTC ATC-3′(Hind Ⅲ)

1.4 病毒增殖 將保存的EAV Bucyrus株接種單層RK-13,吸附50 min,2%血清MEM維持液37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。48 h后,當(dāng)出現(xiàn)75%以上細(xì)胞病變(CPE)收毒,-80℃保存。

1.5 EAV GP5蛋白主要抗原域編碼基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體pET-GP5的構(gòu)建 取250 μ L病毒懸液,按華舜 RNA抽提試劑盒操作提取總 RNA。Oligo DT(18)1 μ L 與病毒總 RNA 8 μ L,70℃反應(yīng)5 min,冰浴條件下加入預(yù)先配好的反轉(zhuǎn)錄體系,37℃、1 h,70℃、15 min后結(jié)束反應(yīng),總體系為 18 μ L。取5 μ L反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為 PCR模板,按常規(guī)體系進(jìn)行PCR,退火溫度58℃,時(shí)間30 s,30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

將PCR膠回收產(chǎn)物與pET-30a質(zhì)粒分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切回收目的片段。16℃連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化至DH5α,按常規(guī)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物,37℃培養(yǎng)12 h,LB平板(50 μ g/mL Kan)挑單菌落,接種于 LB 培養(yǎng)基(50 μ g/mL Kan),37℃震蕩培養(yǎng)12 h,保存菌種,提取質(zhì)粒用BamHⅠ和 HindⅢ雙酶切鑒定為陽(yáng)性后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。選取測(cè)序結(jié)果完全一致的陽(yáng)性質(zhì)粒并命名為 pET-GP5,用氯化鈣法制備 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞[5],按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化。

1.6 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化和表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定 將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌接種于LB培養(yǎng)基(50 μ g/mL Kan)中37℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。次日以1%的量接種于5 mL LB培養(yǎng)基(50 μ g/mL Kan)37℃震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)分別加入1.0、0.8、0.6 、0.4、0.2 mmol/L 的 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),并在 2h、4h、6h、8h和過(guò)夜分別取樣進(jìn)行 SDSPAGE分析。

將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液超聲波處理后進(jìn)行SDSPAGE,按常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜及反應(yīng),首抗為His-Tag Monoclonal Antibody,二抗為 Anti-Mouse IgG。用Western blot超敏發(fā)光液顯色。

1.7 重組蛋白的純化及復(fù)性 將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌接種于 50 mL LB 培養(yǎng)基(50 μ g/mL Kan)中培養(yǎng),適當(dāng)OD值時(shí)誘導(dǎo)表達(dá),6 h后收獲菌體細(xì)胞,用5 mL 1×PBS重懸,超聲波處理細(xì)胞重懸液至清亮,4 000 r/min(4℃)離心10 min,分別收獲沉淀和上清液,SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)蛋白以包涵體形式存在。切膠純化表達(dá)蛋白并進(jìn)行透析復(fù)性[6]。

1.8 重組蛋白的抗原性鑒定

1.8.1 重組蛋白反應(yīng)原性的鑒定 用純化后的EAV按常規(guī)方法免疫家兔(免疫間隔15 d)進(jìn)行多克隆抗體的制備,二免7 d后耳緣靜脈采血,間接ELISA測(cè)其效價(jià)不低于10 000時(shí)心臟采血,收集血清。用制備好的兔抗EAV血清為首抗,Anti-Rabbit IgG為二抗,進(jìn)行免疫印跡(Western blot),以鑒定pGP5反應(yīng)性。

1.8.2 重組蛋白免疫原性的鑒定 用純化后的pGP5按常規(guī)方法免疫家兔制備多克隆抗體。獲得血清后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn),以兔抗pGP5免疫血清為首抗,羊抗兔FITC熒光抗體為二抗。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)擴(kuò)增基因序列的同源性和編碼蛋白的抗原性分析 應(yīng)用軟件DNAStar對(duì)EAV GP5蛋白進(jìn)行抗原性分析,GP5蛋白55-98aa區(qū)域具有較強(qiáng)的免疫原性,設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物擴(kuò)增包括其編碼基因,作為目標(biāo)表達(dá)蛋白。

2.2 目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定 提取EAV病毒總RNA,應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增出大小為252bp的片段。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增片段為目的基因。挑取表達(dá)載體轉(zhuǎn)化菌落,振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,應(yīng)用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定,電泳結(jié)果表明目的片段已成功插入表達(dá)載體。

2.3 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化、純化及復(fù)性 不同時(shí)間和不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 結(jié)果,0.2 、0.4 、0,6、0.8 mmol/L 及1.0 mmol/L 的IPTG 和2、4、6 h及 8 h(圖1)均可有效誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá),結(jié)果表明,不同IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)的產(chǎn)量影響不大,但是誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間越長(zhǎng)蛋白表達(dá)的量就越大。根據(jù)試驗(yàn)需要選取0.2 mmol/L的IPTG,4 h為最佳誘導(dǎo)反應(yīng)條件。表達(dá)產(chǎn)物的大小約為17 kDa,與預(yù)期理論值得蛋白分子量相符,占總菌體蛋白含量約為36%。在最佳條件下進(jìn)行大量誘導(dǎo),超聲破碎后收集上清及沉淀,SDS-PAGE表明重組蛋白以包涵體形式出現(xiàn)(圖2)。切膠純化并復(fù)性。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的抗原性鑒定

2.4.1 Western印跡 Western blot的結(jié)果表明,純化復(fù)性后的pGP5與兔抗EAV pGP5陽(yáng)性血清反應(yīng),在17 kDa處出現(xiàn)1條特異性的條帶(圖3),表明pGP5有良好的反應(yīng)原性。

圖3 兔抗EAV高免血清的Western blot

2.4.2 間接免疫熒光試驗(yàn) 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示,制備的兔抗pGP5免疫血清能特異性地與接種EAV 24 h后的RK-13細(xì)胞發(fā)生反應(yīng),熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)特異性熒光,而對(duì)照胞漿內(nèi)沒(méi)有特異性熒光(圖4),說(shuō)明pGP5具有較好的免疫原性。

圖4 間接免疫熒光的檢測(cè)(400×)

3 討論

馬病毒性動(dòng)脈炎主要引起馬呼吸與繁殖系統(tǒng)障礙,嚴(yán)重影響賽馬質(zhì)量。國(guó)際上也規(guī)定,凡是微量中和試驗(yàn)血清1∶4結(jié)果為陽(yáng)性的馬匹不準(zhǔn)進(jìn)出口[7]。2008年奧運(yùn)會(huì)以后,隨著中國(guó)賽馬業(yè)日漸鼎沸,EVA檢出率也隨之上升。可能是由于2008年奧運(yùn)會(huì)后,賽馬業(yè)快速發(fā)展,而EAV防治相對(duì)滯后的結(jié)果。EAV具有高度接觸傳染性,呼吸道吸入、交配和人工授精是主要傳播途徑。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)引進(jìn)種馬精液及馬廄衛(wèi)生的管理,以減少傳染源。我國(guó)對(duì)EAV的研究較少,梁成珠等(1996年)曾應(yīng)用中和試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)進(jìn)行過(guò)進(jìn)出境馬匹的抗體檢疫和監(jiān)測(cè),黃從平、路承平等(2000年)利用EAV的血凝特性檢測(cè)出入境馬血清樣本均檢出過(guò)EAV抗體陽(yáng)性馬,但是未分離到病毒。所以在實(shí)際工作中,需要一種能準(zhǔn)確檢測(cè)EAV抗體的方法,這對(duì)檢疫檢測(cè)人員提高工作效率具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

研究證實(shí),病毒蛋白質(zhì)GP5可刺激機(jī)體引起體液免疫反應(yīng),這便導(dǎo)致產(chǎn)生了應(yīng)用細(xì)菌或桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備部分或整個(gè)重組蛋白作為包被抗原可檢測(cè) EAV抗體[8-10]。本研究應(yīng)用 DNAStar對(duì)EAV GP5蛋白進(jìn)行抗原性分析,運(yùn)用RT-PCR技術(shù)從EAV Bucyrus株基因組中克隆了 EAV GP5蛋白的主要抗原域編碼基因,并成功的進(jìn)行了GP5蛋白的高效表達(dá)及純化,免疫印跡及間接免疫熒光試驗(yàn)表明,表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。為準(zhǔn)確檢測(cè)EVA及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供有利的條件。

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