邱 楊,肖性龍,趙 麗,劉建麗,余以剛,吳 暉

(1.東莞出入境檢驗檢疫局,廣東 東莞 523072; 2.華南理工大學輕工與食品學院,廣東 廣州 510640;3.深圳太太基因工程有限公司,廣東 深圳 518057)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,對偶蹄獸有重大危害?？谔阋卟《竟灿?個血清型,各個血清型的病毒之間不能產生交叉免疫。因此,口蹄疫病毒快速準確的分型是口蹄疫診斷的重要內容,可為疫苗的選擇和流行病學研究提供有價值的信息。目前我國主要受周邊國家和地區(qū)O、AsiaⅠ、A三種血清型病毒的威脅,本試驗建立了多重熒光 RTPCR方法用于區(qū)分上述3種血清型FMDV。相比于常規(guī)的診斷方法,PCR檢測具有準確直接的優(yōu)點,對于口蹄疫病毒的快速定型具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 毒株 口蹄疫病毒O、A型和AsiaⅠ型標準抗原購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。水泡性口炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型等動物病毒均由深圳出入境檢驗檢疫局的實驗室分離、保存。

1.2 設備和試劑 ABI7500實時熒光PCR儀;Genequant Pro型核酸蛋白分析儀;TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、TaKa-Ra One Step RNA PCR Kit均為寶生物工程(大連)有限公司產品。

1.3 引物和探針的設計與合成 根據基因庫中登錄的O型 、A型和AsiaⅠ型序列篩選出各病毒的保守區(qū)段,分別設計 3對特異PCR引物和 Taq Man探針。將發(fā)射波長相差較大的熒光染料基團,分別標記O型、A型和AsiaⅠ型的 Taq Man探針5′端。上述引物和Taq Man探針均由上?；瞪锛夹g有限公司合成、標記,具體序列和探針標記見表1。

表1 O型 、A型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒引物和探針序列

1.4 多重熒光RT-PCR的檢測方法的建立和條件優(yōu)化 在T aKaRa一步法RT-PCR基礎上,對O型、A型 和AsiaⅠ型多重熒光RT-PCR反應體系中引物和Taq Man探針濃度進行篩選,對PCR反應條件、PCR的各循環(huán)參數(shù)進行優(yōu)化,以獲得最低的Ct值和較高的熒光強度增加值(△Rn)。

1.5 多重熒光RT-PCR的特異性試驗 取O型、A型和AsiaⅠ型以及其他7株常見動物RNA病毒細胞培養(yǎng)液,分別提取核酸作為模板進行多重熒光RT-PCR檢測,觀察結果確定其特異性。

1.6 多重熒光 RT-PCR的靈敏度檢測 提取O型、A型和AsiaⅠ型病毒液的總RNA,分別進行10倍系列稀釋(10-1～10-5),以每個稀釋度的核酸作為模板進行多重熒光RT-PCR檢測,觀察其最低的檢測限。

1.7 多重熒光RT-PCR的干擾性試驗 將O型、A型和AsiaⅠ型標準樣品不同的模板濃度進行組合,進行多重熒光RT-PCR檢測,確定濃度相差較大時各標準樣品之間的檢測是否存在相互干擾現(xiàn)象。

1.8 多重熒光RT-PCR臨床試驗 利用所建立的多重實時熒光RT-PCR對送檢的10批283份樣品進行臨床檢測,并與ELISA和病毒分離鑒定結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 多重熒光RT-PCR的條件優(yōu)化 結果表明,O型、A型和AsiaⅠ型各引物和探針采用以下濃度擴增效果最好:400 nmol/L O型-F,400 nmol/L O型-R,200 nmol/L O型-P,400 nmol/L A型-F,400 nmol/L A型-R,200 nmol/L A型-P,400 nmol/L AsiaⅠ型-F,400 nmol/L AsiaⅠ型-R和200 nmol/L AsiaⅠ型-P。優(yōu)化后的反應程序如下:42℃30 min反轉錄;94℃4 min終止反轉錄;94℃15 s,55℃1 min,重復40個循環(huán)。

2.2 多重熒光RT-PCR方法的特異性 用所建立的多重熒光RT-PCR對其他7株常見動物RNA病毒進行檢測,結果呈陰性反應。試驗數(shù)據表明所設計的引物探針,只對目的病毒特異,與其他檢測對象無交叉反應。

同時加入O型、A型和AsiaⅠ型的口蹄疫病毒RNA于一管中進行三聯(lián)模板的檢測,結果表明3種血清型口蹄疫病毒分別得到相應的特異性擴增曲線(見圖1)。此外,利用該方法對單一模板和二聯(lián)模板進行檢測。分別只加入O型、A型和AsiaⅠ型其中一種病毒RNA進行單一檢測,結果表明3種血清型的口蹄疫病毒均得到相應的特異性擴增曲線;分別將 O型、A型和 AsiaⅠ型其中兩種病毒RNA加入一管進行二聯(lián)檢測,結果表明,該方法至少可同時檢測出兩種血清型的口蹄疫病毒。

圖1 多重熒光RT-PCR同時檢測O型、A型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒

2.3 多重熒光RT-PCR的檢測靈敏度 結果多重熒光RT-PCR可以單獨檢測的O型最低稀釋度為10-3,達到2.68 pg/μ L濃度的病毒RNA。用同樣試驗方法證實多重熒光RT-PCR對A型、AsiaⅠ型單檢的分析敏感度分別為10.52 pg/μ L和30.56 pg/μ L(圖 2 、3、4)。

2.4 熒光RT-PCR重復性試驗 試驗結果如表2所示,當其中一病毒RNA模版濃度較高而另一個病毒RNA模板濃度較低時,所建立的方法依然可以同時檢測到各個目的病毒。

圖4 AsiaⅠ型單檢靈敏試驗

2.5 多重實時熒光RT-PCR臨床試驗 利用所建立的多重實時熒光RT-PCR對送檢的10批283份樣品進行檢測,結果檢測到O型陽性5份、A型陽性2份、AsiaⅠ型3份,其中有1份為 O型和亞 A-siaⅠ型的混合感染。所檢測結果與口蹄疫單重熒光RT-PCR分型方法和病毒分離鑒定、ELISA檢測結果符合率為100%。

3 討論

本研究主要在同一反應管內進行3個亞型的擴增檢測反應,同時收集代表3個不同亞型的熒光信號,對擴增產物進行實時在線檢測,從而建立了能夠同時檢測口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ三種亞型的多重實時熒光RT-PCR方法。實驗室階段的試驗和田間試驗均證實,該方法是一種快速、簡便、高效的檢測平臺。

臨床出現(xiàn)混合感染時,兩種或多種病原的含量相差較大[1-2]。為了與實際情況相符,將口蹄疫O、A、AsiaⅠ三種亞型的模板濃度進行調整、組合,從而探討高濃度模板對低濃度模板是否存在干擾現(xiàn)象。結果發(fā)現(xiàn),在3個模板濃度相差較大時,仍可以進行三重檢測,一個或兩個較高濃度亞型的模板對低濃度亞型的擴增檢測影響不大。即使存在有混合感染,其中一種亞型是以潛伏感染的形式存在,病毒量很低,本方法也可準確檢測區(qū)分出來。

目前,國內外檢測口蹄疫的RT-PCR方法主要分為兩種[3],一種是口蹄疫通用型檢測方法。這種方法不能區(qū)分口蹄疫病毒的亞型,不能準確了解疫病的流行動態(tài);另一種是用不同的試劑盒區(qū)分口蹄疫病毒各個亞型的單重檢測方法,操作繁瑣,費時費力。多重實時熒光 RT-PCR可同時進行口蹄疫3種亞型的檢測,大大縮短檢測周期。

[1]Cooke J N,Westover K M.Serotype-specific differences in antigenic regions of foot-and-mouth disease virus(FMDV):A comprehensive statistical analysis[J].Infect Genet Evol,2008,8(6):855-863.

[2]Tong LIN,Jun-zheng DU,Jun-jun SHAO,et al.Application of VP1 Protein to Develop Monoclonal Antibody against Footand-mouth Disease Virus AsiaⅠType[J].Virologica Sinica,2009,24(3):215-220.

[3]張亮,衛(wèi)廣森.口蹄疫診斷技術的研究進展[J].中國獸藥雜志,2009(4):20.