張?zhí)?凌宗帥,史玉穎,高小博,田國寧,張金玲,韓 亮,張麗萍

(1.濰坊出入境檢驗檢疫局,山東濰坊261041; 2.濟南出入境檢驗檢疫局,山東 濟南250010;3.山東省農業(yè)科學院家禽研究所,山東濟南250023; 4.北京盈九思科技發(fā)展有限公司,北京朝陽100029)

禽白血病是由反轉錄病毒科禽白血病病毒和肉瘤病毒群中的病毒引起的雞的各種可傳播的良性和惡性腫瘤。根據(jù)在不同遺傳型雞胚成纖維細胞上的宿主范圍、與相同或不同亞群成員的干擾模式以及病毒囊膜抗原分為 A、B、C、D、E和 J6個亞群。該病具有水平傳播和垂直傳播兩種特性,并以垂直傳播為主,且還存在內源性病毒[1-2]。熒光定量PCR技術以其靈敏度高、特異性好、快速、準確等優(yōu)點,在病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用。本文針對ALV的保守序列LTR設計引物和探針,建立了ALV的實時熒光定量 RT-PCR檢測方法,為快速診斷和監(jiān)測禽白血病提供了一種新的快速有力的手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 1 材料 病毒材料為實驗室保存的2002年～2008年分離的不同的ALV毒株,分別為 ALV-1-2002,ALV-3-2003,ALV-1-2005,ALV-4-2008。用于特異性分析的新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性囊病病毒(IBD)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)和馬立克病病毒(MDV)均由實驗室保存,Taq DNA聚合酶、MMLV逆轉錄酶、dNTPs、質粒純化試劑盒購自美國Promega公司,pEASY-T載體購自全式金生物技術有限公司,T rizol購自美國Invitrogen公司,ALV抗原ELISA檢測試劑盒購自IDEXX公司。

1.1.2 儀器 美國ABI公司的7500型熒光定量PCR儀、德國 EPPENDORF公司5810R、5417冷凍離心機、法國VILBER公司的凝膠成像系統(tǒng)、德國EPPENDORF公司的蛋白核酸分析系統(tǒng)等。

1.2 引物和探針的設計 選取ALV病毒的LT R序列,利用Primer Express 2.0軟件設計引物和探針序列如下:

引物 ALV-F1:5′-AGACCAAATAAGGAAAAAGCAAGA-3′;

引物 ALV-R1:5′-ATAATCGTACATAGCT T CGTCTAC-3′;

探針 :5′-CGTCAT TCCTTCCTTATCTAGTCGC CAC-3′

探針的5′端標記 FAM 熒光基團,3′端標記BHQ-1,由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3 標準陽性對照的制備 本試驗所用的標準陽性對照為實驗室構建的含有ALV LTR序列的質粒。將引物ALV-F1和ALV-R1擴增的PCR產物克隆到載體pEASY-T上,采用PCR驗證陽性克隆,然后再進行測序,命名為pEASY-ALV。然后將經驗證的陽性克隆用 LB培養(yǎng)基(含100μ g/mL氨芐青霉素)增殖[3],采用質粒純化試劑盒提取質粒DNA。用核酸分析儀測定質粒DNA的OD260,按照文獻[4]方法計算其拷貝數(shù),作為標準陽性樣品。

1.4 組織RNA的提取 取雞的腎、脾、腦等組織,混合再進行勻漿,采用Invitrogen公司的T rizol提取核酸,按照說明書進行病毒RNA的提取。

1.5 實時熒光定量 RT-PCR反應 5 μ L 5×RTPCR mix(包含Taq DNA polymerase,M-MLV逆轉錄酶,dNTPs和MgCl2等 RT-PCR反應成分),0.25 μ mol/L ALV-F1,0.25 μ mol/L ALV-R1,0.25 μ mol/L 探針和 ALV 模板 ,補充水至 25 μ L。PCR反應參數(shù)如下:42℃30 min,95℃10 min,95℃10 s,60℃1 min,在60℃采集熒光,進行 40個循環(huán)。

1.6 ALV實時熒光定量RT-PCR檢測方法的靈敏度和特異性 ALV質粒 DNA以3.0×102～3.0×107系列稀釋,進行實時熒光定量RT-PCR,每個稀釋度做兩個平行。測定該方法的檢測靈敏度,并繪制標準曲線。分別提取ALV不同分離株、新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性囊病病毒、雞傳染性貧血病毒、馬立克病病毒的核酸,測定該方法的特異性。

1.7 數(shù)據(jù)分析 熒光RT-PCR反應結束后,利用SDS 1.2軟件進行數(shù)據(jù)分析,根據(jù)標準曲線可以得出待檢樣品中的病毒含量。

1.8 臨床樣品的檢測 送檢的90個有生長發(fā)育不良,胸腺、腔上囊萎縮等臨床癥狀的雞的泄殖腔棉拭子樣品,采用實時熒光定量RT-PCR方法和ELISA抗原檢測試劑盒進行檢測。

2 結果

2.1 定量PCR反應檢測ALV的靈敏度試驗 將質粒pESAY-ALV的進行10倍系列稀釋,每個稀釋度做兩個平行,進行 ALV實時熒光定量 RTPCR檢測。圖1 A表示質粒pEASY-ALV各個稀釋度的擴增曲線。其中 X軸代表PCR反應循環(huán)數(shù),Y軸Rn代表熒光信號強度?？梢钥闯?質粒濃度為3.0×102～3.0×107個拷貝6個數(shù)量級的范圍內定量 RT-PCR有“S”型擴增曲線,即反映了PCR的指數(shù)增長期,線性增長期和平臺期3個階段。進一步分析擴增曲線,發(fā)現(xiàn)指數(shù)增長期的曲線平行,反映了PCR的擴增效率相近;而不同稀釋度之間的Ct相差均勻,符合定量PCR的Ct值與起始拷貝數(shù)之間嚴格的線性關系。每個稀釋度的兩個重復,其擴增曲線基本吻合在一起,反映了試驗的平行性好。根據(jù)質?？截悢?shù)與Ct值的相關性,由SDS2.1軟件得到標準曲線,見圖1 B。橫坐標代表質粒拷貝數(shù)(X),縱坐標為 Ct值。標準曲線方程:Y=3.12X+39.6,相關系數(shù)R2=0.997。標準曲線在3.0×107～3.0×102拷貝范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系,檢測下限為30個拷貝。

2.2 ALV實時熒光定量RT-PCR檢測方法的特異性試驗 提取 ALV不同分離株以及新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性囊病病毒、雞傳染性貧血病毒和馬立克病病毒的核酸,進行ALV實時熒光定量RT-PCR檢測其特異性,擴增曲線見圖2?？梢钥闯?ALV不同分離株擴增曲線呈“S”型,而新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性囊病病毒、雞傳染性貧血病毒和馬立克病病毒的沒有典型的“S”型擴增曲線,表明沒有發(fā)生擴增反應,結果顯示建立的ALV實時熒光定量RT-PCR檢測方法具有很好的特異性。

圖1 ALV實時熒光定量RT-PCR的靈敏度檢測圖

圖2 ALV特異性試驗的熒光定量RT-PCR的擴增曲線圖

2.3 實時熒光定量RT-PCR反應檢測待檢樣品中的ALV 用建立的定量RT-PCR反應方法檢測90個待檢的雞的泄殖腔棉拭子樣品。在檢測過程中,以ALV RNA、健康雞組織RNA為模板,分別作為陽性對照、陰性對照。排除假陽性和假陰性結果。定量PCR結果表明,陽性對照有“S”型擴增曲線,空白對照和陰性對照無明顯的“S”型擴增曲線,且熒光信號值低。表明試驗過程符合質量控制的要求,可以排除假陽性和假陰性結果。定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),有56個雞的泄殖腔棉拭子樣品有“S”型擴增曲線,且熒光信號值高,可判斷其含有ALV病毒,擴增曲線見圖3,檢出率為 56/90,而ELISA方法檢出率為51/90,二者結果基本吻合。

3 討論

圖3 臨床樣本中ALV實時熒光定量RT-PCR的擴增曲線圖

禽白血病給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經濟損失,特別是對蛋種雞等的影響巨大,淘汰率很高。目前本病沒有有效的治療辦法和有效的藥物和疫苗預防。因此建立快速、特異和高通量的檢測方法是預防和控制本病首要之選[5-6]。本研究建立的實時熒光定量RT-PCR檢測禽白血病的方法,特異性好,只從禽白血病陽性病料中檢測到特異性的擴增信號,不與檢測的其他常見家禽傳染病發(fā)生特異性反應;對禽白血病的檢測靈敏度為30個拷貝/反應,靈敏度高;檢測量大,一次可以檢測90份樣品,整個反應都在密閉的系統(tǒng)內進行,避免了樣品間的污染;檢測速度快,從樣品處理包括RNA的提取,PCR等到試驗結束,大約需要4個小時的時間,比其他的血清學檢測方法節(jié)省了時間;準確性高,Taq Man探針只與特異性的模板發(fā)生反應,假陽性率低,與Sybr Green染料相比,不需要考慮引物二聚體和其他非特異性擴增[7-8]。

本文結合ABI 7500熒光檢測系統(tǒng),建立了Taq Man探針實時定量RT-PCR法快速、準確檢測家禽中的ALV。反應體系包括一對引物和一條探針(長度為都為19 bp),探針5′端標記熒光報告基團,3′端標記熒光淬滅基團。當探針完整時,兩基團在空間結構上距離相互靠近,5′端報告基團產生的熒光被3′端淬滅基團淬滅,故體系中沒有熒光信號的產生。在PCR退火和延伸過程中,探針與模板特異性結合,隨著引物的延伸,Taq DNA聚合酶利用其5′-3′端外切酶活性,對探針進行切割,報告基團遠離淬滅基團,報告基團所釋放的熒光可以被檢測,熒光量的增加與PCR產物的積累量呈比例關系,可以達到定量檢測的目的。

本文建立的ALV的檢測體系中,引物和探針只與ALV核酸特異性地結合,與其他的家禽傳染病的核酸都沒有反應,表明引物和探針的特異性較好。標準曲線在3.0×102～3.0×107拷貝范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系,檢測下限為30個拷貝。定量PCR僅需要2 h操作,一次可以進行96個樣品的檢測,PCR反應結束后可立即觀察結果,不需要電泳、染色,因此更方便、快速。

本研究建立的方法不僅克服了禽白血病病毒分離的費時費力的缺點,減少了檢測時間,節(jié)省了大量的人力和財力。不僅能用于養(yǎng)殖場中禽白血病的快速檢測,為雞場減少損失,而且還可以用于家禽和禽肉產品中禽白血病的快速檢測,為進出口檢驗檢疫提供可靠的檢測方法。

[1]Saif Y M.禽病學[M].蘇敬良,高福,索勛,譯.11版.北京:中國農業(yè)出版社,2005.

[2]殷震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京:科學出版社,1997.

[3]薩姆布魯克 J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯 T.分子克隆實驗指南[M].金冬雁,黎孟楓,譯.2版.北京:科學出版社,1999.

[4]Giulietti A,Overbergh L,Valckx D,et al.An overview of realtime quantitative PCR:applications to quantify cytokine gene expression[J].Methods,2001,25:386-401.

[5]崔治中,張志,杜巖.我國肉用型雞群中J亞型白血病流行現(xiàn)狀的調查[J].中國預防獸醫(yī)學報,2002,24(4):292-294.

[6]成子強,趙振華,郝永清,等.禽白血病病毒J亞群(ALV-J)的血清學調查及PCR診斷[J].中國病毒學,2002,17(4):324-329.

[7]Brownie J,Shawcross S,Theaker J,et al.T he elimination of primer-dimer accumulation in PCR[J].Nucleic Acids Res,1997,25:3235-3241.

[8]Halford W P,Falco V C,Gebhardt B M,et al.T he inherent quantitative capacity of the reverse transcription-polymerase chain reaction[J].Anal Biochem,1999,266:181-191.