張彥紅,樊惠英,蔡紹鑫,羅開健,廖 明,任 濤

(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院農(nóng)業(yè)部動物疫病防控重點開放實驗室,廣東廣州510642)

鵝副黏病毒病是由鵝副黏病毒(goose paramyxovirus,GPMV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病。該病以腸道糠麩樣潰瘍,胰腺、脾臟腫脹且表面有大小不等的灰白色壞死灶為主要特征[1]。自1997年首次在國內(nèi)被發(fā)現(xiàn)后[2],目前該病在山東、廣西、安徽、浙江、上海、遼寧、云南和江蘇等地區(qū)廣泛流行[3],嚴重影響了我國養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。本研究擬對實驗室保存的鵝副黏病毒61/GO/GD/05分離株進行生物學特性試驗,以期全面認識、了解其特性,為禽副黏病毒的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株 鵝副黏病毒61/GO/GD/05株、NDV陽性血清由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院農(nóng)業(yè)部動物疫病防控重點開放實驗室提供。

1.2 實驗動物 9～11日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司;粵黃雞苗購自華南農(nóng)業(yè)大學種雞場;1日齡清遠鵝購自清遠市博士鵝業(yè)有限公司。

1.3 試劑 T rizol LS Reagent購自 Invitrogen公司;Reverse T ranscriptase XL(AMV)、RNA酶抑制劑(PRI)、dNTPs、DNA Marker DL-2 000、Ex Taq聚合酶為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.4 病毒的增殖與傳代 將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水稀釋1 000倍,尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚5枚,0.2 mL/枚,37℃孵育72 h,逐日觀察,期間棄去24 h以內(nèi)死亡的雞胚,最終無菌收集尿囊液,作為第1代尿囊液毒。如此反復(fù)傳代至第3代,收集第3代尿囊液毒作為工作用種毒,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測定 將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水作連續(xù)10倍稀釋(10-6～10-10),每個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種8枚10日齡的SPF雞胚,0.2 mL/枚,37℃孵育72 h,逐日觀察,期間棄去24 h以內(nèi)死亡的雞胚,最終無菌采集尿囊液并測定其HA效價,以HA效價為4log2以上判為陽性。按照 Reed-Muench法計算 61/GO/GD/05分離株的EID50。

1.6 雞胚最小致死量的平均死亡時間(MDT)的測定 參照OIE試驗及判定標準進行[4],將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水作連續(xù)10倍稀釋(10-6～10-10),每個稀釋度接種5個雞胚,0.2 mL/枚,每天觀察4次,連續(xù)觀察7 d。記錄每個雞胚的死亡時間。

1.7 腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)的測定 參照OIE試驗及判定標準進行[4],將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水作10倍稀釋后經(jīng)腦內(nèi)接種10只1日齡SPF雛雞,每只接種0.05 mL,另設(shè)10只注射生理鹽水,作為對照組,隔離飼養(yǎng)。接種后,每24 h觀察發(fā)病及死亡情況并打分,連續(xù)觀察8 d。

1.8 靜脈致病指數(shù)(IVPI)的測定 參照OIE試驗及判定標準進行[4],將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水作10倍稀釋后,接種10只6周齡的SPF雞,每只靜脈接種0.1 mL,另設(shè)10只注射生理鹽水作為對照,隔離飼養(yǎng),每24 h觀察1次,連續(xù)觀察10 d。根據(jù)發(fā)病和死亡情況,通過對每只雞的記分(正常0分,患病1分,麻痹 2分,死亡 3分)計算IVPI。

1.9 對雛雞、雛鵝的致病性試驗 將61/GO/GD/05株尿囊液作10倍稀釋后,通過腿部肌肉注射接種10只21日齡的非免疫雞和鵝,0.2 mL/只。同時設(shè)生理鹽水對照組10只。攻毒后觀察15 d,記錄發(fā)病及死亡情況。

1.10 對鵝半數(shù)致死量(LD50)的測定 將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水作連續(xù)10倍稀釋(10-0～10-5),每個稀釋度分別經(jīng)腿部肌肉注射接種10只14日齡NDV陰性的健康鵝,0.5 mL/只。另取10只為生理鹽水對照組。攻毒后觀察15 d,記錄發(fā)病及死亡情況,采用Reed-Muench法計算出LD50。1.11 分子生物學特性

1.1 1.1 引物設(shè)計 參考GenBank上的APMV基因組序列,使用 DNAStar(Verison5.07)和 Primer Premier(Version5.0)軟件設(shè)計擴增F基因的特異性引物,引物序列如下:P1:F-P1:5′-attat GGATCCATGGGCTCCAAACCTTCTACCAGGT TCC-3′(BamH Ⅰ ),F-P2:5′-attat GGATCC TCATGCTCCTGTAGTGGCTC-3′(BamH Ⅰ),預(yù)計擴增長度約為1 662 bp。

1.1 1.2 RNA提取及RT-PCR 用Trizol Reagent提取病毒RNA,將 RNA沉淀溶于15 μ L DEPC水中;然后參照 Reverse T ranscriptase XL(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,參照 Ex Taq聚合酶使用說明書進行 PCR,PCR產(chǎn)物參照快速純化試劑盒說明書進行回收。

1.1 1.3 序列測定及遺傳變異分析 對回收后的PCR產(chǎn)物進行測序,測序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。應(yīng)用DNAStar 5.07軟件拼接測序后的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。將GPMV 61/GO/GD/05分離株與國內(nèi)外13株APMV-1參考株的F基因進行序列相似性分析,并按照Lmniczi等[5]建立的方法對61/GO/GD/05分離株進行基因分型。

2 結(jié)果

2.1 61/GO/GD/05分離株生物學特性的測定結(jié)果 見表1。

表1 61/G O/GD/05分離株生物學特性的測定結(jié)果

2.2 對雛雞的致病性試驗 攻毒后3 d,雞只開始陸續(xù)發(fā)病,主要表現(xiàn)為精神沉郁、羽毛松散、閉眼昏睡、癱臥在地、拉稀等癥狀。剖檢死亡雞,發(fā)現(xiàn)腺胃有出血點、胰腺壞死及腸道出血。雞只的死亡率和發(fā)病率見表2。

表2 61/GO/GD/05分離株對雞、鵝的致病性試驗 (%)

2.3 對雛鵝的致病性試驗 攻毒后第4天鵝開始發(fā)病,主要表現(xiàn)為精神沉郁,食欲減退。剖檢病死鵝,可見食管、氣管黏液增多,腸道出血,腺胃肌胃交界處輕微出血,脾臟腫大,胰腺腫大、壞死、出血(見圖1)。在攻毒后第7天采咽喉拭子和泄殖腔拭子進行病毒分離。鵝的死亡率和發(fā)病率,見表2。

圖1 61/GO/GD/05分離株對鵝致病性試驗圖譜

2.4 RT-PCR結(jié)果 對61/GO/GD/05分離株的病毒RNA進行了RT-PCR擴增,擴增片段與預(yù)期大小相符,電泳檢測結(jié)果見圖2。

圖2 F基因的PCR擴增

2.5 F基因序列分析及基因型 將GPMV 61/GO/GD/05分離株與GenBank上13株APMV毒株的F基因進行核苷酸序列相似性分析,發(fā)現(xiàn)61/GO/GD/05毒株與我國早期分離的GPMV SF02和ZJ1毒株相似性最高,分別為98.3%和98.0%,與Clone 30的相似性最低,為84.2%(圖3);與F48E9毒株的相似性為86.6%?；蛐头治霰砻?該毒株為基因Ⅶ型,為我國目前主要流行基因型。F蛋白的裂解位點的氨基酸組成為RRQKRF,符合GPMV強毒株裂解位點堿性氨基酸組成的特點。

3 討論

本試驗的GPMV 61/GO/GD/05分離株的MDT值為78 h,ICPI值為1.70,IVPI值為2.34。后兩項指標顯示其為強毒力株,而MDT的結(jié)果則顯示其為中等毒力株。Gerganow等[5]也曾分離到一株NDV病毒,MDT值屬于強毒力型,ICPI值屬于中等毒力型,而IVPI值屬于低毒力型,3個指標均不一致,最終該毒株毒力的判定以動物發(fā)病試驗結(jié)果為依據(jù)。本研究中的致病性試驗表明,61/GO/GD/05分離株對21日齡雞的發(fā)病率為100%,死亡率為90%,對16日齡鵝的發(fā)病率為100%,死亡率為50%,表明該病毒對雛雞、雛鵝均具有較強的致病性。

此外,研究已證實GPMV的F蛋白是決定禽副黏病毒毒力的主要決定因素[6-8]。對不同毒株F基因序列分析表明,毒力不同的毒株F基因序列不同,其差異主要表現(xiàn)在F基因裂解位點區(qū)域。強毒株在裂解位點的氨基酸序列為112R-R-Q-K/R-RF117,而弱毒株或無毒株在裂解位點的氨基酸序列為112G-R/K-Q-C-R-L117,而且這一結(jié)論已經(jīng)通過反向遺傳操作技術(shù)得到了證實。用此方法來鑒定NDV的強弱毒已經(jīng)被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)采納。本試驗的GPMV 61/GO/GD/05分離株F蛋白裂解位點區(qū)(112-117)氨基酸的序列分析結(jié)果為RRQKRF,符合NDV強毒株的氨基酸序列特征。因此,綜合以上研究結(jié)果,判定GPMV 61/GO/GD/05分離株為強毒株。

對不同毒株的F基因序列分析表明,61/GO/GD/05毒株與我國早期分離的GPMV SF02和ZJ1毒株相似性最高,分別為98.3%和98.0%,但與我國標準強毒F48E9株相似性僅為86.6%。雖然目前我國廣泛使用雞新城疫常規(guī)疫苗對鵝副黏病毒病進行預(yù)防和控制,但試驗表明此類疫苗的免疫效果并不理想,說明鵝副黏病毒和LaSota株、F48E9株抗原性存在較大差異。

將GPMV 61/GO/GD/05分離株接種健康雛鵝能復(fù)制出與臨床癥狀一致的臨床癥狀和剖檢病變。該病毒的分離鑒定再次證明水禽不再僅是禽1型副黏病毒的宿主和貯存庫,而是已成為禽1型副黏病毒自然感染發(fā)病、死亡的易感禽類。分離的GPMV 61/GO/GD/05株既可引起鵝感染發(fā)病,又對雞有強致病性,推測這可能與長期使用NDV疫苗,使得環(huán)境中免疫壓力增強,導(dǎo)致型禽1副黏病毒發(fā)生變異及水禽(鴨、鵝)與陸禽(雞)混養(yǎng)有關(guān)[9]。

[1]李潔,孫振州,欒爽艷.鵝副黏病毒病的研究進展[J].水禽世界,2006(6):55-58.

[2]辛朝安,任濤,羅開健,等.鵝副黏病毒感染診斷初報[J].養(yǎng)禽與禽病防治,1997,16(1):5-8.

[3]張倩,王志亮,單虎,等.鵝源新城疫的生物學特性分析[J].中國獸醫(yī)學報,2006,26(6):6-9.

[4]Office International des Epizootes.Newcastle disease[EB/OL].http://www.oie.int.

[5]Lmniczi B,Wehmann E,Herczeg J,et al.Newcastle disease outbreaks in recent yearsin western Europe were Caused by an oid(?)and a novel genotype(?)[J].Arch Virol,1998,143:49-64.

[6]Bruce S,Mark G,Janice C,et al.Genomic sequences of lowvirulence avian paramyxovirus-1(Newcastle disease virus)isolates obtained from live-bird markets in North America not related to commonly utilized commercial vaccine strains[J].Veterinary Microbiology,2005,106:7-16.

[7]Scott J G,Jill T,Bradd C B,et al.Isolation of Avian Paramyxovirus 1 from a Patient with a Lethal Case of Pneumonia[J].Journal of Virology,2007,81(22):12709-12714.

[8]秦卓明,馬保臣,賈強,等.一株基因H型新城疫強毒株的分子特性[J].微生物學報,2006,42(6):912-916.

[9]胡永強,單松華,何水林,等.鵝源副黏病毒 SF02株的生物學特性研究[J].上海農(nóng)業(yè)學報,2004(2):109-113.