柳 超,蔣朋飛,曹金鎖,張德禮

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院病毒免疫與生物信息研究室,陜西楊凌712100)

趨化因子是一種能夠趨化和活化白細(xì)胞的細(xì)胞因子,在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的趨化因子有CXC,CC,CX3C和 C共四族。淋巴細(xì)胞趨化因子(Lptn)為趨化因子C家族成員,可由CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、γ δ T 細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生,主要作用于 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK 細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等[1]。Lptn的結(jié)構(gòu)、功能等在人及小鼠中研究較為深入,目前人和小鼠的Lptn單克隆抗體已實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)。Zavala-Flores L M等[2]已成功用乳酸桿菌表達(dá)了人淋巴細(xì)胞趨化因子,并在體外做了活性驗(yàn)證,而Lptn的研究在豬體內(nèi)卻未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此本研究構(gòu)建了豬淋巴細(xì)胞趨化因子(PLptn)真核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染至豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞系(SUVEC),在體外測(cè)定了其趨化生物學(xué)活性,為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 T rizol Reagent試劑、Lipofectamine TM 2 000購(gòu)自Invitrogen公司,RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司,premix Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶購(gòu)自 TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司,Anti-GFP Antibody購(gòu)自天根生物科技有限公司,羊抗鼠IgG/HRP購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司,DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司,6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Costar公司,Western blot所用聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)為美國(guó)Millipore生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 豬胸腺組織總 RNA提取 T rizol法從健康成年長(zhǎng)白豬胸腺組織中提取總RNA。

1.2.2 PLptn cDNA的獲得 按常規(guī)的 RT-PCR方法進(jìn)行,根據(jù)GenBank登錄號(hào)為NM_001134345序列設(shè)計(jì)引物,序列如下 Upper:5′-CGCAAGCTTCCATGAGACT TCTCATC-3′,Lower:5′-TAGGATCCCTACCCAGTCAGGGT T-3′。PCR 總 體系為 25 μ L,反應(yīng)體系如下 :12.5 μ L Taq DNA polymerase,上下游引物(20 pmol)各 0.5 μ L,1.25 μ L反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,10.25 μ L ddH2O。反應(yīng)參數(shù)為:95℃5 min,30個(gè)循環(huán)(94℃30 s,56℃30 s,72℃30 s),最后72℃延伸10 min。

1.2.3 真核載體pEGFP-PLptn的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物純化后與pMD-18T載體連接,構(gòu)建亞克隆載體pMD-18T-PLptn,轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)氨芐抗性篩選、測(cè)序及雙酶切對(duì)重組菌進(jìn)行鑒定。將正確的目的基因連接至pEGFP-C1中,構(gòu)建真核載體pEGFP-PLptn。

1.2.4 真核載體pEGFP-PLptn轉(zhuǎn)染SUVEC 抽提真核載體pEGFP-PLptn,紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。將SUVEC細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板上,待細(xì)胞 80%～90%融合時(shí),按 LipofectamineTM 2 000說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染,48 h后觀察熒光強(qiáng)度。

1.2.5 PLptn Western blot檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞,裂解抽提蛋白,樣品處理后,進(jìn)行Western blot檢測(cè)。首抗為小鼠單克隆抗體Anti-GFP antibody(1∶2 000),二抗為 HRP標(biāo)記的抗鼠二抗Goat Anti-mouse IgG/HRP(1∶3 000)。

1.2.6 趨化試驗(yàn) 通過(guò)檢測(cè)豬外周血液中的淋巴細(xì)胞的遷移來(lái)反映Pig Lptn活性,結(jié)果以趨化指數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA濃度和純度 紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取總RNA的濃度和純度,結(jié)果為OD260/OD280=1.84±0.01,OD260/OD230=1.32±0.01,RNA 的濃度為66±0.01 ng/μ L。

2.2 PLptn cDNA的獲得 以從健康成年長(zhǎng)白豬胸腺組織中提取總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,擴(kuò)增出PLptn編碼基因全長(zhǎng)序列,結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)軟件Bioxm2.6分析,所得序列與GenBank登錄號(hào)為NM-001134345序列完全一致。

圖1 PLptn的PCR擴(kuò)增

2.4 pEGFP-PLptn轉(zhuǎn)染SUVEC結(jié)果 紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒pEGFP-PLptn和pEGFP-C1的濃度和純度,結(jié)果為 pEGFP-C1:OD260/OD280=1.94±0.01,OD260/OD230=2.27±0.01,濃度為378.8±0.01 ng/μ L;pEGFP-PLptn:OD260/OD280=1.93 ±0.01,OD260/OD230=2.35±0.01,濃度為438.2±0.01 ng/μ L。利用熒光倒置顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染pEGFP-PLptn質(zhì)粒的SUVEC觀察,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP-PLptn后48 h熒光表達(dá)量最多,見(jiàn)圖2-3、2-4,圖2-1、2-2為pEGFP-C1轉(zhuǎn)染48 h后結(jié)果。

圖2 pEGFP-C1和 pEGFP-PLptn轉(zhuǎn)染SUVECs后的熒光顯微鏡檢測(cè)(100×)

2.5 PLptn在SUVEC中表達(dá)的檢測(cè) Western blot結(jié)果顯示重組載體樣品表達(dá)約43 ku的蛋白,而空載體pEGFP-C1表達(dá)自身約33 ku的蛋白,說(shuō)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-PLptn在SUVEC中成功表達(dá),PLptn基因編碼的蛋白大約10 ku,與已知相符,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)PLptn的表達(dá)

2.6 趨化試驗(yàn)結(jié)果 用pEGFP-PLptn轉(zhuǎn)染細(xì)胞系SUVEC,趨化試驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白對(duì)豬外周血淋巴細(xì)胞的趨化活性,結(jié)果如下:趨化游走距離(A):32 μ m,自發(fā)游走距離(B):11 μ m,趨化指數(shù)(A/B)為2.9。表明PLptn能在SUVEC中表達(dá),而且表達(dá)的PLptn具有趨化豬外周血淋巴細(xì)胞的生物學(xué)活性。

3 討論

Lptn在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡、增強(qiáng)黏膜免疫、抗腫瘤等方面都發(fā)揮重要作用,臨床上與腎炎、移植排斥、病毒感染、過(guò)敏性哮喘等多種疾病相關(guān)[3]。對(duì)其功能和作用機(jī)制的研究已相對(duì)成熟。PLptn編碼由110個(gè)氨基酸殘基組成的多肽,該多肽序列含Chemokine-C 、Chemokine、Chemokine-CC 和 SCY 等功能域,與羊和人的氨基酸序列相似率分別為81.6%和68.4%[4]。具有相似序列的蛋白質(zhì)具有相似的功能,又PLptn具有與Lptn相同的結(jié)構(gòu)域Chemokine-C,這提示我們PLptn可能具有上述和人淋巴細(xì)胞趨化因子Lptn相似的功能。這為研究PLptn的功能和作用機(jī)制提供了一種思路,我們可以參考Lptn的研究方法來(lái)研究PLptn的功能。本試驗(yàn)成功克隆了豬淋巴細(xì)胞趨化因子編碼基因全長(zhǎng)序列。構(gòu)建了pMD-18T-PLptn和真核載體pEGFPPLptn,經(jīng)鑒定均無(wú)誤。轉(zhuǎn)染細(xì)胞Western blot結(jié)果顯示,目的基因已成功表達(dá),體外趨化活性試驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白對(duì)豬淋巴細(xì)胞具有趨化活性,為研究PLptn生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

[1]Ordway D,Henao-Tamayo M,Smith E,et al.XCL1(lymphotactin)chemokine produced by activated CD8(+)T cells during the chronic stage of infection with My cobacterium tuberculosis negatively affects production of IFN-gamma by CD4(+)T cells and participates in g ranuloma stability[J].Leukoc Biol,2007,82(5):1221-1229.

[2]Zavala-Flores L M,Villatoro-Hernandez J,Gamez-Escobedo A,et al.Production of biologically active human lymphotactin(XCL1)by Lactococcus lactis[J].Biotechnol Lett,2009,31(2):215-220.

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[4]宋豪,張德禮.豬淋巴細(xì)胞趨化因子X(jué)CL1的電子克隆和編碼區(qū)序列RT-PCR驗(yàn)證[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,12:11-16.

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