黃蓉

腸球菌是醫(yī)院感染常見菌，其中糞腸球菌約占80%～90%，其次是屎腸球菌，約占50%～15%[1]。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的腸球菌及耐高濃度氨基糖甙類腸球菌，特別是耐萬古霉素腸球菌的出現(xiàn)，給臨床治療帶來極大的困難[2]。此2種腸球菌的耐藥性差異性很大，快速準(zhǔn)確地從臨床標(biāo)本中區(qū)分、鑒定2種腸球菌已迫在眉睫。熒光原位雜交法采用標(biāo)記不同熒光素的2條探針，可在2h內(nèi)在一張玻片上同時快速鑒定糞腸球菌和屎腸球菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1)標(biāo)準(zhǔn)參考菌株：所有標(biāo)準(zhǔn)菌株購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心，見表1。其中腸球菌11株，鏈球菌3株，葡萄球菌2株，微球菌1株。2)寡核甙酸探針：檢測糞腸球菌的ENF191探針5'端標(biāo)記異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocy-anate, FITC)(綠色信號)，檢測屎腸球菌的ENU14探針5'端標(biāo)記Cy3(紅色信號)，同時以通用探針EUB338和Non-EUB分別作陽性對照和陰性對照，探針由Euro Gentee BV(Maas-tricht，荷蘭)合成，探針的序列見表l。

1.2 方法

1)腸球菌的鑒定：常規(guī)培養(yǎng)后，用法國生物梅里埃AP120 STREP系統(tǒng)鑒定。2)熒光原位雜交法：取臨床標(biāo)本涂片2張，一張用于革蘭染色，若發(fā)現(xiàn)短鏈狀排列的陽性球菌，將另一張先干燥固定，而后96%乙醇固定10min，空氣干燥；以2mg/mL的溶菌酶(Sigma)37℃下處理玻片15～30min，蒸餾水洗滌后干燥(溶菌酶溶于10mmol/LTris，pH8.0的緩沖液中)隨后將玻片置于70%的乙醇固定2min，空氣干燥；加入濃度為10ng/mL的混合探針，探針以10%福爾馬林雜交緩沖液稀釋(20mmol/LTris-HCI，0.9mol/LNaCl，0.1%SDS，pH7.2)，于50℃下雜交30min～1h；置玻片于洗滌緩沖液中(20mmol/LTris-HCI，180mmol/LNaCl，pH7.2)于50℃下洗滌10min，蒸餾水洗滌后空氣干燥；滴上1滴熒光媒介油，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對每條探針而言，敏感性即雜交法檢出的靶細(xì)菌的陽性數(shù)占樣本中靶細(xì)菌數(shù)的百分比，特異性即雜交法檢出的靶細(xì)菌的陰性數(shù)占樣本中非靶細(xì)菌數(shù)的百分比，以傳統(tǒng)檢測方法的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 雜交條件的優(yōu)化

1)血培養(yǎng)標(biāo)本溶菌酶37℃處理15min，其他標(biāo)本溶菌酶37℃處理30min。2)血培養(yǎng)標(biāo)本50℃下雜交30min，其他標(biāo)本50℃下雜交1h即可見到較強(qiáng)的熒光信號。

2.2 探針的特異性評價

在本研究中，使用了糞腸球菌3株，屎腸球菌1株，其他腸球菌7株，葡萄球菌屬2株，鏈球菌屬3株，微球菌1株。對探針的特異性進(jìn)行測試表明，ENF191探針和ENU140探針分別只與糞腸球菌和屎腸球菌發(fā)生特異性結(jié)合，與屬內(nèi)其他腸球菌及形態(tài)相似的革蘭染色球菌均無交叉反應(yīng)。

2.3 雜交法與培養(yǎng)法結(jié)果比較

在163例腸球菌陽性標(biāo)本中，傳統(tǒng)法檢測出糞腸球菌145株，屎腸球菌12株，其他腸球菌6株；雜交法中ENF191探針檢測出糞腸球菌145株，ENU140探針屎腸球菌12株，其他6株腸球菌2條探針均未能檢出，結(jié)果見表2。

表1 探針序列

表2 雜交法檢測163例腸球菌臨床標(biāo)本結(jié)果評價

3 討論

糞腸球菌和屎腸球菌是腸球菌中最常見的2種菌，可引起傷口、尿道感染及心內(nèi)膜炎。在微生物實驗室，快速、特異、準(zhǔn)確地檢測、鑒定病原菌，可有效地指導(dǎo)臨床使用抗生素[3-4]。通常以自動化儀器或商品化試劑盒鑒定腸球菌，但有時結(jié)果并不可靠。如屎腸球菌可誤鑒定為耐久腸球菌或海氏腸球菌。

16S rRNA基因序列分析最大的優(yōu)勢是檢測速度快，常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)方法無法與其相比。目前常將16S rRNA基因序列分析與形態(tài)學(xué)方法相結(jié)合，對細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)分類，用于臨床常規(guī)的檢測、鑒定[5]。

通過標(biāo)準(zhǔn)菌株對2條探針進(jìn)行測試，顯示出了很好的特異性，對163例腸球菌陽性標(biāo)本進(jìn)行2種方法比較，也證實了2條探針的高度特異性和敏感性，這與探針的設(shè)計和雜交條件的選擇有關(guān)。實驗中發(fā)現(xiàn)，10%福爾馬林可保持雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性。血培養(yǎng)與其他標(biāo)本相比，預(yù)雜交和雜交時間均短，可能與血培養(yǎng)物為快速生長的細(xì)菌、細(xì)胞壁的通透性好有關(guān)。

在送檢前使用過抗生素的標(biāo)本中，可出現(xiàn)革蘭染色陽性。但培養(yǎng)陰性的情況，雜交法不受此因素影響。在各類臨床標(biāo)本中，陽性血培養(yǎng)標(biāo)本可直接鑒定，膿液、傷口分泌物也無需培養(yǎng)直接鑒定，尿液標(biāo)本先離心后也可直接鑒定，但腦脊液、胸腹水等含菌量少的標(biāo)本，受熒光原位雜交(fluorescence in situ hy-bridization, FISH)檢測限103CFU/mL的影響[3]，需經(jīng)培養(yǎng)后才可運(yùn)用雜交法鑒定。

[1]李金鐘.腸球菌分類與鑒定新進(jìn)展[J].臨床檢驗雜志,2006,24(3):228-230.

[2]王斌,朱旭慧,張蓓等.654株腸球菌的耐藥性分析[J].國際檢驗醫(yī)雜志,2006,27(3):285-286.

[3]王沛，Welling GW,Meesen N,等.熒光原位雜交法快速鑒定金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2004,21(2):434-436.

[4]Wellinghausen N,Bartel M,Essig A,et al.Rapid identification of clinically relevant enterococcus species by floresence in situ by-bridization[J].J Clin Microbiol,2007,45(10):3424-3426.

[5]李霞,高謙.16SrRNA基因序列分析在臨床微生物中的應(yīng)用[J].微生物與感染,2006,1(3):184-186.