賈艷菊,代 玲,張 燦

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050061;2.邢臺醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校基礎(chǔ)部,河北邢臺 054000;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島 266109)

龍葵生物堿誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的研究*

賈艷菊1,代 玲2,張 燦3*

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050061;2.邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)部,河北邢臺 054000;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島 266109)

用M TT法觀察龍葵生物堿的體外抗腫瘤作用,用T UNEL染色法檢測龍葵生物堿對HeLa細(xì)胞凋亡的影響,用免疫細(xì)胞化學(xué)方法研究龍葵生物堿對HeLa細(xì)胞PCNA和突變型P53蛋白表達(dá)的影響。濃度為100 μ g/mL～800 μ g/mL的龍葵生物堿對HeLa細(xì)胞的生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用;TUNEL染色結(jié)果提示400 μ g/mL的龍葵生物堿處理HeLa細(xì)胞48 h后,能夠誘導(dǎo)更多的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡;免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)果顯示,400 μ g/mL的龍葵生物堿處理HeLa細(xì)胞48 h后,會使HeLa細(xì)胞中PCNA蛋白和突變型P53蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。結(jié)果表明,龍葵生物堿在體外具顯著抗宮頸癌活性,其作用機(jī)制是通過誘導(dǎo)更多的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡而實(shí)現(xiàn)的。

龍葵生物堿;MT T;T UNEL染色;PCNA;突變型P53;HeLa細(xì)胞

中藥龍葵(Solanum nigrumL)是茄科植物龍葵的地上部分,其全草含多種甾體生物堿,包括澳洲茄邊堿(solamargine)、澳洲茄堿(solasonine)、龍葵堿(solanine)等,也含皂甙等成分。生物堿類化合物大多都能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),腫瘤的發(fā)生可能是由于細(xì)胞凋亡的通路受阻造成的[1-2]。一些研究報道表明,龍葵的醇提物能夠抑制乳腺癌的生長并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3],其中的澳洲茄邊堿有明顯的抗腫瘤作用[4]。龍葵制劑對無轉(zhuǎn)移惡性葡萄胎、手術(shù)切除放療、化療后絨毛膜癌、卵巢癌藥物作用機(jī)制研究已經(jīng)展開;對食道癌、膀胱癌抑制機(jī)制的研究已有報道[5],但龍葵生物堿對宮頸癌的治療作用國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。

本試驗將分離提取的龍葵生物堿作用于人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa),進(jìn)行體外培養(yǎng)試驗,觀察藥物對該細(xì)胞株增殖的影響,并進(jìn)一步探討龍葵生物堿抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,為進(jìn)一步開發(fā)利用龍葵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 龍葵生物堿 龍葵購于青島市同仁堂藥店,經(jīng)同仁堂醫(yī)師鑒定為龍葵。龍葵生物堿的提取參考龐琳琳等[6]的提取方法,并適當(dāng)改進(jìn)。

1.1.2 供試細(xì)胞 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.1.3 主要試劑 超級無支原體胎牛血清、RPMI1640、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶購于Gibco公司;M TT為Sigma公司產(chǎn)品;鼠抗人單克隆抗體P53、PCNA,羊抗鼠單克隆抗體IgG-H RP為Santa Cruz公司產(chǎn)品;T UNEL染色試劑盒購于Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株,以含100 mL/L胎牛血清、1萬單位青霉素、100 mg/L鏈霉素的 RPMI1640培養(yǎng)基,在37℃、50 mL/L的CO2條件下培養(yǎng)。5 g/L胰酶與1 g/L EDTA等體積混合消化細(xì)胞,隔日傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞存活率 參照文獻(xiàn)[7]介紹方法進(jìn)行。細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接細(xì)胞1.0×104個。培養(yǎng) 24 h,加入不同濃度(10、50、100、200、400、800 μ g/mL)的藥物 10 μ L(以 RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋),對照組加入同體積的RPMI1640培養(yǎng)液,每組設(shè)3個平行孔,充分混勻后,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入 MT T 20 μ L(5 g/L,PBS),繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后 ,每孔加入DMSO 150 μ L,充分震蕩溶解,Multiscan MK3型酶標(biāo)儀在492 nm波長處測定各孔OD值,調(diào)零孔則用RPMI1640代替細(xì)胞懸液和藥物。試驗重復(fù)3次。細(xì)胞生長抑制率按下列公式進(jìn)行計算:

生長抑制率(IR%)=[1-試驗組平均OD值/對照組平均OD值]×100%

1.2.3 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 經(jīng)藥物處理后及對照組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106個細(xì)胞/mL,制備細(xì)胞涂片(40 mL/L多聚甲醛固定),然后按試劑盒說明書操作。顯微鏡下觀察細(xì)胞中含有藍(lán)紫色顆粒的細(xì)胞即為凋亡的細(xì)胞。以上試驗重復(fù)二次。

1.2.4 突變型P53和PCNA蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)分析 用400 μ g/mL龍葵生物堿處理后及對照組細(xì)胞用PBS液制成單細(xì)胞懸液,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106個細(xì)胞/mL,滴片,室溫下自然干燥,然后按試劑盒說明書進(jìn)行操作。以2×105個細(xì)胞/孔接種于放置有蓋玻片的6孔板,待自然貼壁后藥物處理48 h后取出置于培養(yǎng)皿中長滿細(xì)胞的蓋玻片,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測試劑盒進(jìn)行SP法免疫組化染色,光鏡低倍鏡下隨機(jī)確定5個視野,每個視野隨機(jī)計數(shù)200個腫瘤細(xì)胞計算突變型P53和PCNA陽性率。

1.2.5 統(tǒng)計分析 用Statisticas 6.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行分析,細(xì)胞存活率組間差異采用單因素方差分析、多重比較采用鄧肯檢驗,突變型P53和PCNA陽性率的組間差異采用t檢驗。P＜0.05,為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 龍葵生物堿對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用

試驗結(jié)果表明,不同處理組的OD值存在顯著差異(F(7,16)=189.5,P=0.00),各龍葵生物堿處理組OD值與空白對照組的相比差異顯著(P＜0.05),并且隨濃度的增加OD值逐漸降低。質(zhì)量濃度為100 μ g/mL～800 μ g/mL的龍葵生物堿對He-La細(xì)胞的生長表現(xiàn)出一定的抑制作用,且隨著濃度的增加抑制率逐漸增加(F(6,14)=140.8,P=0.00),當(dāng)濃度為800 μ g/mL時,龍葵生物堿對 HeLa細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)69.27%,與陽性藥物5-Fu處理效果無顯著差異(P＞0.05)(表1)。

表1 龍葵生物堿對HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用Table 1 Effect of solanine on proliferative activity of HeLa cell line in vitro(±SD)

表1 龍葵生物堿對HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用Table 1 Effect of solanine on proliferative activity of HeLa cell line in vitro(±SD)

注:上標(biāo)字母不同,表示差異顯著P＜0.05。Note:Values with different letters show significant difference P＜0.05.

濃度/(μ g?mL-1)Concentration OD值OD value IR/%Control 1.178±0.018f 10 1.088±0.024e 7.64±3.24a 50 1.017±0.070e 13.67±6.28a 100 0.789±0.023d 33.02±1.94b 200 0.660±0.043c 43.97±4.25c 400 0.521±0.021b 55.77±1.42d 800 0.362±0.074a 69.27±4.42e 5-Fu 0.342±0.018a 70.97±1.43e

2.2 龍葵生物堿對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

DNA片段化是細(xì)胞凋亡的一個標(biāo)志,TUNEL染色結(jié)果如圖1所示。與陰性對照組相比,濃度為400 μ g/mL龍葵生物堿處理的HeLa細(xì)胞,TUNEL染色后的細(xì)胞爬片出現(xiàn)強(qiáng)烈綠色熒光,提示龍葵生物堿在體外能顯著誘導(dǎo)更多的HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.3 龍葵生物堿對HeLa細(xì)胞P53蛋白、核增殖抗原(PCNA)蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步闡明龍葵生物堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑,通過免疫組織化學(xué)的方法檢測龍葵生物堿處理后對HeLa細(xì)胞突變型P53和PCNA蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果如圖2和圖3所示。從結(jié)果中可以看出,龍葵生物堿處理可以使HeLa細(xì)胞突變型p53蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞顯著減少(30.3%±7.7%),與陰性對照組(87.1%±8.9%)相比,差異極顯著(P＜0.01);龍葵生物堿可以使HeLa細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞顯著減少,陽性表達(dá)率為29.5%±9.2%,與陰性對照組(61.7%±7.1%)相比,差異也達(dá)顯著水平(P＜0.05)。

圖1 龍葵生物堿處理對HeLa細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of solanine on the HeLa cell apoptosis

圖2 龍葵生物堿處理對HeLa細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of solanine on the PCNA protein expression of HeLa cells

圖3 龍葵生物堿處理對HeLa細(xì)胞突變型P53蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of solanine on the mutant P53 protein expression of HeLa cells

3 討論

子宮頸癌是婦科臨床比較常見的惡性腫瘤,可分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌及其他類,其中鱗狀細(xì)胞癌約占85%～90%。近幾年來研究表明,腫瘤的發(fā)生不僅是由于細(xì)胞的無限生長,而且細(xì)胞生長抑制因子的喪失及細(xì)胞凋亡的異常同樣會引起腫瘤的形成。

植物生物堿是一類有廣泛生物活性效應(yīng)的成分,近些年的研究表明,多種植物生物堿均顯示出了較強(qiáng)的抗腫瘤活性,如馬齒莧生物堿對A-549肺癌細(xì)胞株[8]、野西瓜生物堿對 HepG-2細(xì)胞株均顯示出很強(qiáng)的抗增殖活性[6]等。其抗腫瘤作用的機(jī)理與對細(xì)胞的直接殺傷作用[9]、干擾細(xì)胞周期作用[10]、誘導(dǎo)細(xì)胞分化[11]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]、逆轉(zhuǎn)細(xì)胞抗凋亡作用[13]等有關(guān)。本試驗首次觀察了龍葵生物堿對人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖作用的影響,結(jié)果表明,龍葵生物堿體外對HeLa細(xì)胞的增殖具有較好的抑制作用,且隨龍葵生物堿濃度的增加而抑制效果增強(qiáng),在處理濃度為800 μ g/mL時,細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)69.27%。T UNEL染色結(jié)果顯示,龍葵生物堿處理以后,細(xì)胞爬片的熒光強(qiáng)度與陰性對照組相比顯著增強(qiáng),提示龍葵生物堿誘導(dǎo)了更多的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是DNA多聚酶δ的輔助蛋白,在細(xì)胞周期的G1后期開始增加,S期達(dá)到高峰,直接參加了細(xì)胞增殖過程中的DNA復(fù)制,其表達(dá)和含量反映了細(xì)胞的增殖活性。PCNA等抗原表達(dá)可作為預(yù)測腫瘤對化療藥物的敏感程度[14],免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果表明,龍葵生物堿處理后,PCNA蛋白表達(dá)量顯著降低,提示藥物處理使細(xì)胞增殖活性顯著降低,該結(jié)果與M TT試驗結(jié)果相一致。

與野生型P53作為一種腫瘤抑制基因不同,突變型P53是一種癌基因,它的過量表達(dá)可能通過使細(xì)胞更易增殖而增加了細(xì)胞的穩(wěn)定性,并且它還可以抑制DNA的修復(fù)和凋亡。除此之外,還有文獻(xiàn)表明突變型P53可以激活端粒酶、激活抗血管生成因子的形成以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。更為重要的是,有研究表明P53的突變與Bcl-2的過量表達(dá)有關(guān)[15]。利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測到的是突變型P53的表達(dá),從試驗結(jié)果來看,龍葵生物堿處理后可以使HeLa細(xì)胞突變型P53蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào),提示龍葵生物堿可能通過下調(diào)突變型P53而修復(fù)野生型P53功能,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)更多的凋亡。

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Study on Apoptosis of HeLa Cells Induced by Solanine

JIA Yan-ju1,DAI Ling2,ZHANG Can3

(1.College of Biological Science and Engineering,Hebei University of Economics&Business,Shijiazhuang,Hebei,050061,China;2.Foundation Department,Xingtai Medical College,Xingtai,Hebei,054000;3.College of Animal Science,Qingdao Agriculture University,Qingdao,Shandong,266109,China)

MTT method was used to explore the anti-neoplastic action of solaninein vitro,T UNEL staining was used to analyze the apoptosis-inducing effect of solanine on HeLa cell line,and immumunocytochemistry method was further used to detect the effects of solanine on the protein expression of PCNA and mutant P53 in HeLa cell line.100 μ g/mL-800 μ g/mL solanine had certain inhibition effect on the growth of HeLa cell line.TUNEL staining results showed that after the treatment of solanine at a dose of 400 μ g/mL for 48 h,more HeLa cells were induced to apoptosis.Immumunocytochemistry analysis showed that after the treatment of solanine at a dose of 400 μ g/mL for 48 h,the expression of PCNA protein and the mutant P53 protein were all down-regulated in HeLa cells.T hese results indicated that solanine had significant anticervical cancer effectin vitro,and its anti-tumor mechanism be correlated with its cell apoptosis-inducing action.

solanine;MTT;T UNEL staining;PCNA;mutant P53;HeLa cell

R285

A

1007-5038(2010)08-0051-04

2010-01-15

賈艷菊(1977-),女,河北石家莊人,講師,博士,主要從事水生生物學(xué)研究。*通訊作者