閆文朝,王天奇,丁 軻,張 玲,韓利方,王新彩

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471003;2.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471003)

DMEM培養(yǎng)結(jié)腸小袋蟲的正交試驗(yàn)*

閆文朝1,王天奇1,丁 軻1,張 玲1,韓利方1,王新彩2

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471003;2.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471003)

利用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),研究了淀粉量、小牛血清比例和培養(yǎng)基初始pH 3個(gè)因素對(duì)結(jié)腸小袋蟲在DMEM培養(yǎng)基中所獲得的最高種群密度的影響。方差分析表明,初始pH影響最大,其次為淀粉量,血清比例影響最小。最佳培養(yǎng)基組成為淀粉40 mg/安瓿、血清150 mL/L(DMEM培養(yǎng)液2.55 mL+0.45 mL小牛血清),最適宜的DMEM培養(yǎng)基初始pH為7.0。

結(jié)腸小袋蟲;正交試驗(yàn)設(shè)計(jì);DMEM培養(yǎng)基

結(jié)腸小袋蟲(Balantidium coli)是一種重要的人畜共患寄生蟲,呈世界性分布,可感染人及豬、牛、鼠類、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物等33種動(dòng)物[1-2]。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)結(jié)腸小袋蟲的研究主要集中在流行病學(xué)的調(diào)查、臨床病例的診斷和治療等方面[3-5]。因此,有必要通過(guò)其體外培養(yǎng)體系的建立,進(jìn)行該蟲的基因分型[6-7]、致病機(jī)制、免疫及藥物篩選等研究。目前用于該蟲體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基有 RSS培養(yǎng)基、LE雙相培養(yǎng)基、TYSGM-9培養(yǎng)基存在配制繁瑣、穩(wěn)定性較差、維持時(shí)間短等問(wèn)題[8-9]。DMEM常用于細(xì)胞培養(yǎng),而結(jié)腸小袋蟲也是一種單細(xì)胞的原蟲,我們利用DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、輔以小牛血清和淀粉在體外成功地培養(yǎng)了這一原蟲,為了進(jìn)一步研究最佳培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件,本試驗(yàn)利用正交設(shè)計(jì)法探討了淀粉量、小牛血清比例及培養(yǎng)液初始pH對(duì)蟲體最高種群密度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲種 采自洛陽(yáng)市孟津縣某豬場(chǎng)自然感染的病豬糞便,直接鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量滋養(yǎng)體,未見(jiàn)包囊。取糞便樣少許接種于改進(jìn)型RSS培養(yǎng)基[9],在28℃條件下培養(yǎng)48 h,鏡檢發(fā)現(xiàn)大量活動(dòng)滋養(yǎng)體后用于試驗(yàn)研究。

1.1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基,10.0 g裝,Lot No.1342967,GIBCOTM;小牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號(hào)為080424;碳酸氫鈉,西安化學(xué)試劑廠生產(chǎn),批號(hào)為080623,分析純;可溶性淀粉,北京海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基廠生產(chǎn),批號(hào)080517,用前取適量裝入潔凈小瓶中高壓滅菌。

1.2 方法

1.2.1 DMEM培養(yǎng)液配制 用高壓滅菌雙蒸餾水溶解DMEM培養(yǎng)基,每1 000 mL加碳酸氫鈉3.7 g。培養(yǎng)基用G6濾器過(guò)濾除菌,4℃保存?zhèn)溆?。使用前根?jù)需要用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)整pH。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以結(jié)腸小袋蟲在培養(yǎng)基中所達(dá)到的最高種群密度為指標(biāo),以培養(yǎng)基中淀粉量/(mg/瓶)(A)、小牛血清比例/(mL?L-1)(B)和初始pH(C)3個(gè)因素為考察對(duì)象,每個(gè)因素選3個(gè)水平,利用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。具體因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.2.3 蟲體接種及結(jié)果觀察 本試驗(yàn)用安瓿進(jìn)行培養(yǎng),每個(gè)安瓿內(nèi)液體總量為3 mL,按比例加入相應(yīng)pH的DMEM培養(yǎng)液和小牛血清,并加入相應(yīng)量的淀粉。一個(gè)試驗(yàn)號(hào)設(shè)計(jì)兩個(gè)平行樣品,分別標(biāo)記,進(jìn)行有重復(fù)觀測(cè)值正交試驗(yàn)[10]。培養(yǎng)基分裝完成后置于28℃平衡20 min,之后每個(gè)安瓿內(nèi)加青霉素和鏈霉素各1萬(wàn)單位/mL,并接種結(jié)腸小袋蟲滋養(yǎng)體懸液50 μ L/安瓿。檢查初始密度后,將安瓿加蓋放入28℃條件下培養(yǎng),每12 h檢查1次,直至樣品種群密度連續(xù)兩次下降為止。檢查時(shí),將每一個(gè)樣品混勻后取 40 μ L,滴于載玻片上,蓋上蓋玻片(18 mm×18 mm),100×鏡暗視野下檢查,計(jì)數(shù)30個(gè)視野下的蟲體數(shù)。同時(shí),利用數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)的滋養(yǎng)體及分裂相拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 以每一個(gè)樣品內(nèi)蟲體最高種群密度為基本數(shù)據(jù),利用有重復(fù)觀測(cè)值正交試驗(yàn)方差分析法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,考查不同因素對(duì)獲得最高種群密度的影響,同時(shí),利用多重比較確定某一因素3個(gè)水平中最佳水平,最終確定培養(yǎng)基最佳組成。

2 結(jié)果

2.1 DMEM培養(yǎng)后的結(jié)腸小袋蟲滋養(yǎng)體

結(jié)腸小袋蟲的滋養(yǎng)體在接種于DMEM并渡過(guò)適應(yīng)期后,可迅速增殖,圖1A為接種培養(yǎng)96 h所獲取的照片。滋養(yǎng)體呈橢圓形或卵圓形,借助纖毛的擺動(dòng)可快速旋轉(zhuǎn)前行,遇到障礙物時(shí)可迅速調(diào)頭,也可改變體形而通過(guò)一定寬度的縫隙。滋養(yǎng)體主要以橫二分裂法進(jìn)行無(wú)性繁殖(圖1B),也見(jiàn)到出芽生殖的無(wú)性繁殖方法(圖1C)和接合生殖(圖1D)。

圖1 DMEM培養(yǎng)基中結(jié)腸小袋蟲滋養(yǎng)體及分裂相Fig.1 T rophozoites and fractionalism of Balantidium coli in DMEM medium

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在初始接種量均為16個(gè)/30個(gè)視野的情況下,除3、5、7三個(gè)試驗(yàn)號(hào)蟲體密度在接種培養(yǎng)后108 h達(dá)到最高值外,其余樣品均于96 h達(dá)到密度最高值。L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment design

(續(xù)表2)

2.3 方差分析

由表2極差可以看出,3個(gè)因素影響作用的主次順序?yàn)镃＞A＞B。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由于MSe1/MSe2＞1,MSe1與MSe2差異顯著,故以MSe2進(jìn)行F檢驗(yàn)和多重比較。F檢驗(yàn)結(jié)果表明,淀粉量對(duì)獲得最高種群密度有顯著影響(P＜0.05),試驗(yàn)范圍內(nèi)不同血清比例對(duì)最高種群密度無(wú)顯著影響(P＞0.05),不同初始pH對(duì)獲得最高種群密度有極顯著影響(P＜0.01)。兩個(gè)組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.4 多重比較

利用SSR法對(duì)不同淀粉量及不同初始pH下最高種群密度平均數(shù)進(jìn)行了多重比較,結(jié)果見(jiàn)表4、表5。40 mg/安瓿(A3)條件下所獲得的最高種群密度極顯著高于30 mg/安瓿(A2),顯著高于20 mg/安瓿(A1),而后兩者差異不顯著。初始pH為7.0(C2)條件下所獲得了最高種群密度極顯著高于6.0(C1)及8.0(C3),后兩者差異也極顯著。

2.5 最佳培養(yǎng)基組成的確定

根據(jù)總體結(jié)果分析,A因素中A3最好,C因素中C2最好,B因素各水平之間差異不顯著,選實(shí)際觀測(cè)值最高的B1水平,因此最佳組合為A3B1C2,即淀粉量為40 mg/安瓿,血清量為150 mL/L(DMEM培養(yǎng)液2.55 mL+0.45 mL小牛血清),DMEM培養(yǎng)液初始pH為7.0。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 The variance analysis for data of orthogonal experiment design

表4 不同淀粉量下最高種群密度平均數(shù)的多重比較Table 4 M ultiple comparisons of the mean of maximum population density under different concentrations of starch(SSR method)

表5 不同初始pH條件下最高種群密度平均數(shù)的多重比較Table 5 M ultiple comparisons of the mean of maximum population density under different initial pH

3 討論

DMEM常用于細(xì)胞培養(yǎng),但用其培養(yǎng)結(jié)腸小袋蟲國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道[8]。在初步試驗(yàn)時(shí),用此培養(yǎng)基加適量的小牛血清和淀粉可進(jìn)行結(jié)腸小袋蟲培養(yǎng)。為了取得良好的培養(yǎng)基組成,本試驗(yàn)利用正交設(shè)計(jì)法研究了培養(yǎng)效果,并進(jìn)行了有重復(fù)觀測(cè)值的方差分析。在所研究的3個(gè)影響因素中,初始pH是最大的影響因素,在初始pH設(shè)定為7.0時(shí)所取得的最高種群密度極顯著高于6.0和8.0,這與利用RSS或改進(jìn)型RSS培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)的初始pH設(shè)定要求基本一致[9-11]。所不同的是,利用RSS或改進(jìn)型RSS培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)初始pH為6.5及8.0時(shí),蟲體在初期少量增殖后密度迅速下降,表現(xiàn)明顯的不適應(yīng)性,而本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在初始pH 為6.0和8.0條件下,蟲體仍然有一定繁殖能力,其原因須進(jìn)一步研究[12]。

結(jié)腸小袋蟲通常以橫二分裂法及接合生殖法繁殖,但在本試驗(yàn)觀察到蟲體還有出芽生殖方式,蟲體的末端先長(zhǎng)出一個(gè)小的舌狀小突,之后舌狀小突逐漸長(zhǎng)大并從母體脫落而成為一個(gè)新個(gè)體。

DMEM營(yíng)養(yǎng)豐富,配制及使用方便,在適宜的初始pH條件下,可獲得比RSS或改進(jìn)型RSS培養(yǎng)基更高的蟲體種群密度[9,11]。因此,在今后的研究中,可用DMEM培養(yǎng)基取代RSS或改進(jìn)型RSS培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)腸小袋蟲的體外培養(yǎng)。

[1]蔣金書.動(dòng)物原蟲病學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出社,2000:329-333.

[2]Solaymani-Mohammadi S,Petri W A.Zoonotic implications of the swine-transmitted protozoal infections[J].Vet Parasitol,2006,140(3-4):189-203.

[3]Bilal C Q,Khan M S,Avais M,et al.Prevalence and chemotherapy ofBalantidium coliin cattle in the River Ravi region,Lahore(Pakistan)[J].Vet Parasitol,2009,163(1-2):15-17.

[4]侯意諦.獼猴結(jié)腸小袋纖毛蟲(Balantidium coli)在猴群中感染情況調(diào)查[J].動(dòng)物學(xué)研究,1989,10(12):151-154.

[5]王天奇,董發(fā)明,楊光忠,等.洛陽(yáng)地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)結(jié)腸小袋纖毛蟲感染情況調(diào)查及分析[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2007,24(8):34-36.

[6]Ponce-Gordo F,Jimenez-Ruiz E,Martinez-Diaz R A.Tentative identification of the species ofBalantidiumfrom ostriches(Struthio camelus)asBalantidium coli-like by analysis of polymorphic DNA[J].Vet Parasitol,2008,157(1-2):41-49.

[7]Nilles-Bije M L,Rivera W L.Ultrastructural and molecular characterization ofBalantidium coliisolated in the Philippines[J].Parasitol Res,2010,106(2):387-394.

[8]Schuster F L,Lynn R A.Current world status ofBalantidium coli[J].Clin Microbiol Rev,2008,21(4):626-638.

[9]王天奇,丁 軻,張 玲,等.改進(jìn)型 RSS培養(yǎng)基體外培養(yǎng)結(jié)腸小袋纖毛蟲的效果研究[J].湖北畜牧獸醫(yī),2008,10:6-8.

[10]明道緒.生物統(tǒng)計(jì)附試驗(yàn)設(shè)計(jì)[M].2版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2002:311-314.

[11]王天奇,閆文朝,丁 軻,等.RSS培養(yǎng)基體外培養(yǎng)結(jié)腸小袋纖毛蟲的效果觀察[J].中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲病,2008,16(6):17-21.

[12]張紹麗,馬洪鋼,宋微波.海洋纖毛蟲—巨大擬阿腦蟲的實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)研究Ⅲ.pH對(duì)種群生長(zhǎng)的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2001,7(3):244-247.

YAN Wen-chao1,WANG Tian-qi1,DING Ke1,ZHANG Ling1,HANG Li-fang1,WANG Xin-cai2

Orthogonal Experimental Design on Culture ofBalantidium coliin DMEM Medium

(1.Animal Science and Technology College,HenanUniversity of Science and Technology,Luoyang,Henan,471003,China;2.Medical College,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan,471003,China)

The effects of three factors including concentrations of starch and serum proportion,the initial pH value of culture solution DMEM on the maximum population density ofBalantidium coliwere evaluated by L9(34)orthogonal design.The variance analysis of the experimental results showed that the initial pH was the primary factor,followed by concentrations of starch,and serum proportion had the weakest effect.The best medium for culture ofB.coli in vitrowas 40 mg/bottle of starch,serum proportion 150 mL/L in culture solution(2.55 mL culture solution DMEM +0.45 mL serum).The optimum initial pH of culture solution DMEM was 7.0.

Balantidium coli;orthogonal design;DMEM medium

S855.9

A

1007-5038(2010)08-0034-04

2010-04-12

河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2009B23003)

閆文朝(1978-),男,河南淅川人,博士,主要從事原蟲分子遺傳學(xué)與免疫學(xué)研究。