宋建領(lǐng),石鳳海,田建國,葉叢華,張文東,趙煥云,呂 粵,岳 亮,李華春,邱 薇,馮子良,張思東,范泉水,張應(yīng)國,張富強(qiáng)*

(1.云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明650224;2.臨滄市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南臨滄67000;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),云南昆明650223;4.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南昆明650051;5.成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心,云南昆明650032)

云南省禽流感、新城疫與3種免疫抑制性病原共感染的檢測(cè)

宋建領(lǐng)1,石鳳海2,田建國3,葉叢華3,張文東4,趙煥云4,呂 粵4,岳 亮4,李華春1,邱 薇5,馮子良5,張思東4,范泉水5,張應(yīng)國4,張富強(qiáng)5*

(1.云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明650224;2.臨滄市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南臨滄67000;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),云南昆明650223;4.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南昆明650051;5.成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心,云南昆明650032)

為調(diào)查云南省禽流感病毒、新城疫病毒與免疫抑制性病毒混合感染的情況,對(duì)云南省2007年1月～2009年10月期間145份禽流感陽性及30份新城疫陽性樣品進(jìn)行禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒(REV)、J亞群禽白血病病毒(ALV-J)及雞傳染性貧血病毒(CIAV)的檢測(cè)。禽流感陽性樣品中ALV-J的感染陽性率為15.9%,REV的感染陽性率為22.8%,CIAV的感染陽性率為26.9%;新城疫陽性樣品中ALV-J的感染陽性率為13.3%,REV的感染陽性率為23.3%,CIAV的感染陽性率為26.7%;共有30份樣品發(fā)生多重感染,多重感染率為17.1%。對(duì)不同區(qū)域的4份禽白血病病毒陽性樣品、10份禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒陽性樣品、10份禽傳染性貧血病毒陽性樣品進(jìn)行了序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明,云南ALV-J毒株gp85基因與國內(nèi)外毒株核苷酸及氨基酸同源性分別介于80.4%～96.7%、85.2%～94.5%;REV毒株env基因核苷酸及氨基酸之間的同源性為98.8%～99.8%、97.7%～99.5%;CIAV毒株vp2基因核苷酸及氨基酸之間的同源性為92.4%～100.0%、93.7%～100.0%。

禽流感病毒;新城疫病毒;gp85基因;env基因;vp2基因

隨著國內(nèi)畜牧業(yè)的不斷發(fā)展,養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展也非常迅速,伴隨著快速的發(fā)展,雞的傳染性疾病也越來越多,而這其中大多數(shù)都與免疫抑制性疾病相關(guān)。在養(yǎng)禽業(yè)中,雞傳染性貧血、馬立克病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生、禽白血病等免疫抑制病的共同特征是引起雞群原發(fā)感染,侵害機(jī)體的免疫器官,使感染雞的免疫功能受到損害,導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降,進(jìn)而引發(fā)其他疾病的并發(fā)或繼發(fā)感染,使病情復(fù)雜造成更大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。免疫抑制病感染雞群后一般不表現(xiàn)臨床癥狀,通常是亞臨床感染或混合感染,在一定程度上給疾病的防治帶來較大困難,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的間接經(jīng)濟(jì)損失[4]。另外,免疫抑制病嚴(yán)重影響禽類的生產(chǎn)性能,尤其對(duì)肉雞的生長(zhǎng)影響最大[5]。因此分析免疫抑制病流行病學(xué)及其與當(dāng)前禽類的重大流行病的相關(guān)性,將為禽類傳染病的預(yù)防控制奠定理論基礎(chǔ),減少養(yǎng)禽業(yè)因疾病引起的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 云南省內(nèi)的禽類喉拭子或泄殖腔拭子,經(jīng)禽流感和新城疫RT-PCR檢測(cè)的145份禽流感陽性及30份新城疫陽性樣品。

1.1.2 試劑 病毒RNA/DNA提取試劑盒(Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0)、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒及質(zhì)粒(小量)抽提試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司;PCR擴(kuò)增試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;PCR Amplification kit、RNA 酶抑制劑購自TaKaRa公司;pMD18-T載體均購自寶生物工程(大連)有限公司;DH5α大腸埃希氏菌及其感受態(tài)細(xì)胞由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備、保存。

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的禽白血病病毒gp85基因序列、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒env基因序列、禽傳染性貧血病病毒vp2基因序列及相關(guān)文獻(xiàn)[6-7],分別設(shè)計(jì)檢測(cè)引物 ALVH5F/ALVH7R、EV1/EV2、RENV-1/RENV-2、RENVF/RENVR、CIAVF/CIAVR詳細(xì)情況見表1。

表1 PCR和RT-PCR引物Table 1 Primers used for PCR and RT-PCR

1.2.2 病毒基因組RNA/DNA的抽提 按試劑盒提供操作步驟進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系的配置,按試劑盒說明書操作。

1.2.3 特異性分析及克隆 將PCR檢測(cè)的陽性樣品,產(chǎn)物經(jīng)電泳分離,凝膠切割純化,定量,確定目的基因濃度后,克隆T載體。

1.2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定 取10 μ L克隆反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后,涂布Ampcilin抗性平板過夜,挑取孤立的白色菌落,采用PCR鑒定陽性菌落。陽性菌落增殖培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒,再經(jīng)PCR進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定,置-20℃保存。

1.2.5 序列分析 陽性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用DNA Man Version 5.2.2軟件進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析。

圖1 禽白血病病毒RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR results of env gene of A LV-J

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)試驗(yàn)篩選優(yōu)化具體反應(yīng)條件分別為:雞傳染性貧血:95℃1 min;94℃50 s,52℃50 s,72℃1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸 10 min。禽白血病:42℃45 min,95℃5 min;94℃30 s,52℃30 s,72℃1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病:42℃45 min;95℃5 min;94℃30 s,56℃30 s,68℃1 min 30 s,35個(gè)循環(huán);68℃延伸10 min。用禽白血病病毒特異性引物檢測(cè)禽白血病樣品,獲得與預(yù)期結(jié)果一致的545 bp PCR產(chǎn)物(圖1)。用雞傳染性貧血特異性引物檢測(cè)雞傳染性貧血樣品,獲得與預(yù)期結(jié)果一致的582 bp PCR產(chǎn)物(圖2)。網(wǎng)狀內(nèi)皮增生,獲得與預(yù)期結(jié)果一致的642 bp PCR產(chǎn)物(圖3)。

圖2 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 Fig.2 RT-PCR results of REV

圖3 禽傳染性貧血病毒PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR results of CIA V

2.2 混合感染結(jié)果

145份禽流感陽性樣品中ALV-J陽性的23份,陽性率為 15.9%;REV陽性的 33份,陽性率為22.8%;CIAV陽性的39份,陽性率為26.9%;30份新城疫陽性樣品中ALV-J陽性的4份,陽性率為13.3%;REV陽性的7份,陽性率為23.3%;CIAV陽性的8份,陽性率為26.7%;共有30份樣品(禽流感24份,新城疫6份)發(fā)生多重感染,多重感染率為17.1%。其中9份樣品(禽流感8份,新城疫1份)出現(xiàn)ALV-J和CIAV二重感染,7份樣品出現(xiàn)REV和CIAV二重感染(禽流感3份,新城疫4份),9份樣品(禽流感9份,新城疫0份)出現(xiàn)ALV-J和REV二重感染,5份樣品(禽流感4份,新城疫1份)出現(xiàn)ALV-J、REV及CIAV三重感染。

2.3 陽性樣品序列分析

2.3.1 禽白血病病毒gp85基因序列分析 選擇不同區(qū)域的4份禽白血病病毒陽性樣品進(jìn)行了序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果表明,云南 ALV-J毒株gp85基因與國內(nèi)外毒株核苷酸及氨基酸同源性分別為80.4%～96.7%和85.2%～94.5%。系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖4。

圖4 白血病病毒gp85基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree for the gp85 genes of ALV

云南禽白血病病毒株的氨基酸序列與美國源型株ADOL-hc-1和英國源型株HPRS-103相比較,云南毒株在 61 、65、112、113、114、184、188、189 aa 出現(xiàn)變異,在63、115、185 aa～187 aa缺失導(dǎo)致云南毒株在62 aa～64 aa的糖基化位點(diǎn)丟失(表2)。

表2 ALV-J gp85基因氨基酸的缺失及潛在糖基化位點(diǎn)的變異Table 2 Deletion of amino acid and variation of potential glycosylation sites of gp85 gene in ALV-J

2.3.2 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒env基因序列分析

選擇不同區(qū)域的10份禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒陽性樣品進(jìn)行了序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明,云南REV毒株env基因核苷酸及氨基酸之間的同源性為98.8%～99.8%和97.7%～99.5%。與國內(nèi)外毒株核苷酸和氨基酸之間的同源性都在95%以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖5。

圖5 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒env基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree for the env genes of REV

2.3.3 禽傳染性貧血病毒vp2基因序列分析 選擇不同區(qū)域的10份禽傳染性貧血病毒陽性樣品進(jìn)行了序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明,云南CIAV毒株vp2基因核苷酸及氨基酸之間的同源性在92.4%～100.0%、93.7%～100.0%。與國內(nèi)外一些毒株核苷酸及氨基酸之間的同源性在92.1%～100.0%、95.0%～100%(圖6)。

3 討論

本次檢測(cè)樣品中 ALV-J陽性率為 13.3%～15.9%,REV陽性率22.8%～23.3%;CIAV陽性率為26.7%～26.9%,多重感染率為17.1%,比國內(nèi)外報(bào)道感染陽性率偏低[5]。這可能與病料的采集有一定的關(guān)系,本次檢測(cè)主要以檢測(cè)禽流感的感染情況為主,只采集了喉拭子和泄殖腔拭子,未采集內(nèi)臟器官樣品。而免疫抑制病主要侵害免疫系統(tǒng)。

我國部分商業(yè)化雞群中免疫抑制病的感染已經(jīng)相當(dāng)普遍,在廣西、安徽、山東、河南、北京、內(nèi)蒙古等地均有報(bào)道[8-10],其中雞傳染性貧血病的陽性檢出率高達(dá)65.6%,其中存在二重、三重甚至四重感染的報(bào)道[5,11-12]。在云南省內(nèi)感染禽流感的雞場(chǎng)中雞傳染性貧血病、禽白血病和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病均存在不同程度的感染,甚至出現(xiàn)兩種或三種混合存在的多重感染。因此免疫抑制病可能是引發(fā)我國部分地區(qū)雞群出現(xiàn)免疫失敗或多種疾病混合感染的原因之一,在疾病的防治方面應(yīng)當(dāng)充分考慮免疫抑制病存在的因素。

圖6 禽傳染性貧血vp2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree for the vp2 genes of CIAV

ALV-J可通過垂直傳播和水平傳播引起成年肉雞的骨髓細(xì)胞瘤,導(dǎo)致很高的死亡率、腫瘤發(fā)生、生產(chǎn)性能降低、淘汰費(fèi)用增加等,對(duì)肉雞的飼養(yǎng)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于本病的診斷方法很多,如病毒分離、免疫組化、原位雜交以及PCR技術(shù)等[13-14]。ALV-J囊膜糖蛋白的 env gp85基因與其他亞群ALV相比,缺少93-126堿基對(duì),與其他 A-E亞群ALV的env gp85基因只有40%同源性,而A-E亞群間的同源性為80%～85%。因此,gp85囊膜糖蛋白是ALV-J的亞群表型決定因素。通過檢測(cè)gp85囊膜糖蛋白或 env gp85編碼基因,可以確診該病[15]。本研究根據(jù)ALV-J囊膜糖蛋白的env gp85基因設(shè)計(jì)引物,建立的PCR診斷方法為該病的診斷奠定了基礎(chǔ)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,云南ALV毒株與國外毒株和國內(nèi)最早發(fā)現(xiàn)毒株都有很大的差異,而云南毒株zhaotong51-55與北京毒株BJ0302親緣關(guān)系更近。

REV感染自然宿主后,大多情況不會(huì)對(duì)機(jī)體細(xì)胞造成損害,但某些情況下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化(瘤細(xì)胞化)或引起細(xì)胞病變,這在被感染宿主的免疫器官表現(xiàn)尤為明顯。REV與其他免疫抑制病混合感染,引起的免疫抑制效果更大[16]。云南毒株與國內(nèi)外代表毒株沒有太大的差異,說明REV毒株的env基因在核苷酸水平上比較保守,幾乎沒有任何變異。

雞傳染性貧血病以貧血、胸腺萎縮、骨髓黃化、造血機(jī)能障礙和免疫機(jī)能受損為主要特征。自1979年Yuasa N等[17]在日本首次分離到雞傳染性貧血病病毒以來,世界上許多國家包括我國在內(nèi)相繼證明了該病毒的存在。目前,CIA對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害不斷上升,已引起世界各養(yǎng)禽國家的廣泛關(guān)注。云南禽傳染性貧血病病毒毒株與國外一些毒株核苷酸之間的同源性為92.1%～100.0%,與天津毒株的核苷酸同源性在99.1%以上,表明云南毒株vp2基因變異不大。

[1]崔治中,杜 巖,趙文明,等.禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒感染和雞群的免疫抑制[J].中國獸藥雜志,2000(1):3-5.

[2]劉公平,趙振芬,劉福安,等.禽白血病病毒研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2000,20(6):621-623.

[3]楊克禮,俆滌平,梁望旺,等.雞傳染性貧血病研究進(jìn)展[J].家禽科學(xué),2007(4):41-45.

[4]姜世金,孟珊珊,崔治中,等.我國自然發(fā)病雞群中MDV、REV和CAV共感染的檢測(cè)[J].中國病毒學(xué),2005,20(2):164-167.

[5]崔治中,孟珊珊,姜世金,等.我國白羽肉用型雞群中CAV、REV和REOV感染狀況的血清學(xué)調(diào)查[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,37(2):152-157.

[6]Pham T D,Spencer J L,Johnson E S.Detection of avian leucosis virus in albumen of chicken eggs using reverse transcription poly merase chain reaction[J].J Virol M athods,1999,78:1-11.

[7]Kim Y,Gharaibeh S M,Stedman N L,et al.Comparison and verification of quantitative competitive reverse transcription poly merase chain reaction(QC-RT-PCR)and real time RT-PCR for avian leucosis virus subg roup J[J].J Virol M athods,2002,102:1-8.

[8]何勇群,張中直,楊漢春.北京地區(qū)雞群網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病感染的血清學(xué)調(diào)查研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),1998,29(1):71-78.

[9]劉岳龍,崔治中,段玉友.PCR和斑點(diǎn)雜交檢測(cè)雞傳染性貧血病毒[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),1996(1),16:38-41.

[10]徐鑌蕊,董衛(wèi)星,余春明,等.蛋雞J亞群禽白血病的分子生物學(xué)診斷[J].病毒學(xué)報(bào),2005,21(4):289-292.

[11]張 志,崔治中,姜世金.從 J亞群禽白血病腫瘤中檢測(cè)出禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,24(1):10-13.

[12]崔治中.免疫抑制性病毒多重感染在雞群疫病發(fā)生和流行中的作用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2003,34(5):417-421.

[13]Spencer J L.Progress towards eradication of lymphoid leukosis viruses-a review[J].Avian Pathol,1984,13(5):599-619.

[14]Pham T D,Spencer J L,Vicki L,et al.Detection of exogenous and endogenous avian leukosis virus in commercial chicken eggs using reverse transcription and poly merase chain reaction assay[J].Avian Pathol,1999,28(3):385-392.

[15]Bai J L,Payne N,Skinner M A.HPRS-103(exogenous avianleukosis virus,subgroup J)has an env gene related to those of endogenous elements EAV-0 and E51 and an E element found previously only in sarcoma viruses[J].J Virol,1995,69(6):779-784.

[16]李廣興,劉忠貴,郎躍深.SPF雛雞感染網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒后白細(xì)胞介素2和干擾素誘生活性的變化[J].中國獸醫(yī)科技,2000,30(4):3-5.

[17]Yuasa N,Taniguehi T,Yoshida I.Isolation and Some characteristics of an agent inducing anemia in chickens[J].Avian Dis,1979,23(4):366-385.

Detection of Mixed Infections of AIV,NDV and Three Kinds of Immunosuppressive Viruses in Yunnan Province

SONG Jian-ling1,SHI Feng-hai2,TIAN Jian-guo3,YE Cong-hua3,ZHANG Wen-dong4,ZHAO Huan-yun4,L¨U Yue4,YUE Liang4,LI Hua-chun1,QIU Wei5,FENG Zi-iang5,ZHANG Si-dong4,FAN Quan-shui5,ZHANG Ying-guo4,ZHANG Fu-qiang5

(1.Y unnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Laboratory,K unming,Y unnan,650224,China;2.Centre for Animal Disease Control and Prevention of Lincang,Lincang,Y unnan,677000,China;3.Yunnan Agriculture University,K unming,Yunnan,650223,China;4.Centre f or Animal Disease Prevention and Control,Y unnan province,K unming,Y unnan,65001,China;5.Centre for Disease Prevention and Control,Cheng Du Military Region,K unming,Y unnan,650032,China)

In order to investigate the mixed infections of AIV,NDV and immunosuppressive viruses in Yunnan province,145 positive samples for AIV and 30 positive samples for NDV were detected by RT-PCR for poultry Reticuloendothelial virus(REV),J subgroup avian leukosis virus(ALV-J)and chicken infectious anemia virus(CIAV)from January 2007 to October 2009 in Yunnan Province.In positive for AIV samples,ALV-J infection rate was 15.9%,REV was 22.8%and CIAV was 26.9%;in positive for NDV samples,ALV-J infection rate was 13.3%,REV was 23.3%and CIAV was 26.7%;a total of 30 samples appeared multiple infections,the infection rate was 17.1%.4 positive ALV-J,10 poultry REV and 10 samples were used for sequence and phylogenetic analysis in different regions of Yunnan province.The results showed that:the nucleotide and amino acid homologies of ALV-J gp85 gene of Yunnan strain with domestic and overseas strains were ranged from 80.4%-96.7%,85.2%-94.5%;the nucleotide and amino acid homologies of env gene of REV strain were 98.8%-99.8%,97.7%-99.5%;the vp2 gene of CIAV strain were 92.4%-100.0%,93.7%-100.0%.

Avian influenza virus;Newcastle disease virus;gp85 gene;env gene;vp2 gene

S858.3

A

1007-5038(2010)08-0024-06

2010-03-01

資金項(xiàng)目:云南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2006NG-24);云南省后備人才基金項(xiàng)目(2009CI061);云南省高層次科技人才培引工

程(20080C002);農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(200803026)

宋建領(lǐng)(1974-),男,山東單縣人,副研究員,主要從事動(dòng)物疾病診斷方法的建立和病原表位分析研究。*