徐明明,劉永剛,王淑杰,武嘉男,石文達(dá),李麗琴,榮福龍,蔡雪輝*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué),黑龍江哈爾濱 150001;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室,黑龍江哈爾濱 150001)

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF3基因的原核表達(dá)*

徐明明1,2,劉永剛2,王淑杰2,武嘉男2,石文達(dá)2,李麗琴2,榮福龍1,2,蔡雪輝2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué),黑龍江哈爾濱 150001;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室,黑龍江哈爾濱 150001)

為進(jìn)一步研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及免疫學(xué)特性,根據(jù)GenBank中已發(fā)表的高致病性PRRSV HuN4株ORF3基因序列,設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增PRRSV ORF3基因的引物。將擴(kuò)增的基因克隆到表達(dá)載體pProEx H Tb中,轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21進(jìn)行表達(dá)。Western blot分析表明,GP3蛋白在大腸埃希菌中獲得正確表達(dá),且具有良好的反應(yīng)活性。將純化的GP3蛋白免疫小鼠制備抗GP3多克隆血清,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定其效價(jià),結(jié)果在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體,證明PRRSV GP3蛋白具有良好的抗原性。

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒;ORF3蛋白;原核表達(dá);抗原性

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)屬于尼多病毒目(Nidovirales)、動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus),能引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),俗稱“豬藍(lán)耳病”。臨床表現(xiàn)為母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和各年齡豬群的呼吸道癥狀。該病于1996年在我國(guó)有發(fā)生的報(bào)道[1],因?yàn)闆]有有效的防控手段,成為養(yǎng)豬業(yè)難以解決的問題。尤其是2006年高致病性豬藍(lán)耳病的暴發(fā),流行范圍廣,傳播速度快,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),病死數(shù)量多,給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,經(jīng)研究證實(shí)高致病性PRRSV(HP-PRRSV)變異株是引起該病的主要病原之一[2]。PRRSV基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA,全長(zhǎng)約15 kb,包括9個(gè)開放閱讀框。根據(jù)血清型和遺傳特性的差異,可將PRRSV劃分為兩個(gè)基因型即歐洲型和美洲型。

PRRSV GP3是蛋白由ORF3基因編碼的一種高度糖基化蛋白,在病毒的致病性、復(fù)制、裝配、變異和保護(hù)性反應(yīng)等方面可能具有重要意義。GP3在病毒粒子中含量較少,研究的也不是很透徹,對(duì)于GP3是否為結(jié)構(gòu)蛋白尚存在爭(zhēng)議[3]。應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)發(fā)現(xiàn)GP3中包含中和表位,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[4]。GP3是PRRSV各毒株之間保守性最差的蛋白之一,將HP-PRRSV與經(jīng)典株進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)GP3的氨基酸突變位點(diǎn)數(shù)量最多。本研究利用大腸埃希菌表達(dá)HP-PRRSV HuN4株GP3,為進(jìn)一步研究GP3的結(jié)構(gòu)、功能及免疫學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株、質(zhì)粒和血清 PRRSV HuN4株、感受態(tài)細(xì)胞JM109、感受態(tài)細(xì)胞BL21、載體質(zhì)粒pProEx HTb,均由豬病綜合防治組保存;PRRSV HuN4株豬陽(yáng)性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所豬病綜合防治組制備并保存。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶(BamHⅠ和EcoRⅠ)、T4 DNA 連接酶、Vector-pMD18T 試劑盒、DNA Marker和蛋白質(zhì)Marker和膠回收試劑盒,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG,購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增與克隆 用生物學(xué)軟件對(duì)PRRSV HuN4株(登錄號(hào)EF635006.1)ORF3基因的氨基酸序列進(jìn)行抗原性、親水性、疏水性等分析,去除位于ORF3基因N端的(1 aa～49 aa)一部分疏水性區(qū)域,設(shè)計(jì)并合成一對(duì)用于擴(kuò)增ORF3基因的引物,上下游引物兩端分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ位 點(diǎn),序 列 為: 上 游 引 物 5′GCTGGATCCAGGGGCAATTTTTCTT -TT 3′;下游引物 5′-ATAC GAATTCCTATTTTGCGAATCGTCGGA-3′,引物的合成由北京百泰克公司完成。以PRRSV HuN4株總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃5 min,94℃1 min;50℃45 s,72℃45 s,35個(gè)循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后連接于pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM109中,提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR和酶切鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pMD18-ORF3。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 將pMD18-ORF3與pProEx HT b同時(shí)經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后,用T4 DNA連接酶22℃連接2 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM109中,提取質(zhì)粒,將經(jīng)酶切鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pH-ORF3。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá) 將重組質(zhì)粒pH-ORF3轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,在轉(zhuǎn)化的平皿中挑取單菌落,37℃振蕩培養(yǎng)過夜,同時(shí)轉(zhuǎn)化載體作為對(duì)照。將培養(yǎng)物以1∶100的比例接種于 LB液體培養(yǎng)基中,于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后 3、4、5、6 h收集菌液,聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 重組蛋白的純化 大量表達(dá)后收集細(xì)菌,分別用 2、4、6 mol/L尿素超聲洗滌包涵體,再用8 mol/L尿素將包涵體溶解。再向其加入2×SDS上樣buffer水煮 5 min后進(jìn)行SDS-PAGE。SDSPAGE結(jié)束后用0.25 mol/L～0.3 mol/L KCl染色凝膠30 s～60 s,對(duì)光將目的蛋白切下,然后用電洗脫儀洗脫5 h,收集蛋白并測(cè)定濃度。

1.2.5 Western blot鑒定 將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后,電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上,50 g/L脫脂乳4℃封閉過夜,加入1∶50倍稀釋的PRRSV豬陽(yáng)性血清,37℃孵育1 h,加1∶20 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG,37℃孵育1 h,DAB顯色5 min,去離子水終止。

1.2.6 小鼠GP3抗血清的制備及測(cè)定 將30 μ g純化的GP3抗原加入等體積的福氏完全佐劑,乳化后采用皮下多點(diǎn)注射免疫6周齡的Balb/c雌性小鼠5只。初次免疫后第14天用同樣抗原加等體積弗氏不完全佐劑進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫,第2次免疫后7 d和28 d分別斷尾采血。以本室制備的昆蟲細(xì)胞表達(dá)并純化的GP3作為包被抗原,采用間接ELISA方法,測(cè)定OD450nm值,檢測(cè)小鼠血清中抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及酶切鑒定結(jié)果

提取HP-PRRSV HuN4株總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,通過特異性引物PCR擴(kuò)增出ORF3基因,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見大約為620 bp的特異性擴(kuò)增片段,與預(yù)期大小相符。陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后,分別切出與目的片段大小一致的片段(圖1),序列測(cè)定結(jié)果表明ORF3基因正確地插入到pProEx HTb載體。

圖1 重組pH-ORF3的酶切鑒定Fig.1 Identification of pH-ORF3 by restriction enzyme digestion

2.2 重組蛋白的表達(dá)及純化結(jié)果

對(duì)誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后3、4、5、6 h的樣品進(jìn)行SDSPAGE分析,同時(shí)設(shè)立空載體誘導(dǎo)4 h為對(duì)照。結(jié)果表明,重組菌在誘導(dǎo)后分別出現(xiàn)大小約為25 ku的蛋白條帶,大小與預(yù)期的蛋白分子質(zhì)量基本一致。重組蛋白的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,目的蛋白在誘導(dǎo)后4 h表達(dá)量最高,隨后表達(dá)量降低。將重組菌超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。用不同濃度的尿素洗滌、溶解包涵體,SDS-PAGE分析重組蛋白雜蛋白很少,進(jìn)一步切膠純化,得到純度較高的目的蛋白(圖2)。

圖2 重組GP3的表達(dá)與純化的SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed and purified GP3

2.3 Western blot鑒定結(jié)果

用PRRSV陽(yáng)性血清與純化的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示GP3在大小約25 ku處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶,空載體對(duì)照未出現(xiàn)條帶(圖3)。表明重組蛋白在大腸埃希菌中得到了正確表達(dá),且表達(dá)的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖3 重組GP3的Western blot鑒定Fig.3 Western blot analy sis of recombinant GP3

2.4 小鼠血清抗體檢測(cè)結(jié)果

以免疫前的小鼠血清及用PBS免疫的小鼠血清作為陰性對(duì)照,以P/N≥2.1的血清最高稀釋度為抗體效價(jià)。結(jié)果顯示,第2次免疫后7 d采血檢測(cè)GP3的抗體效價(jià)為1∶12 800以上,并可持續(xù)到第2次免疫后的第28天。說明表達(dá)的HP-PRRSV HuN4株GP3具有較好的免疫原性,可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3 討論

目前,對(duì) PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5、M、N研究的比較清楚,對(duì)次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3的結(jié)構(gòu)和功能等方面研究的較少。在對(duì)歐洲株LV株的研究中已經(jīng)證明GP3參與病毒粒子囊膜的組裝,是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[5],而對(duì)于加拿大Quebec IAF-Klop株研究表明GP3不是病毒粒子的組成成分,而是弱的膜相關(guān)蛋白[6-7]。最新研究表明,美洲株 FL12株的GP3同歐洲株的一樣,都是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[8]。因?yàn)閷?duì)GP3的結(jié)構(gòu)與功能研究不是很透徹,所得到的結(jié)論也常有互相抵觸的現(xiàn)象,因此有必要對(duì)該蛋白進(jìn)行深入研究。GP3是PRRSV各毒株之間保守性最差的蛋白之一,將HP-PRRSV與經(jīng)典株進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)GP3的氨基酸突變位點(diǎn)數(shù)量最多,共有8個(gè)位點(diǎn)突變,其中有4個(gè)屬于非保守性突變,3個(gè)位于預(yù)測(cè)的抗原表位,1個(gè)位于C末端,第83位保守性突變可能與PRRSV毒力相關(guān)[9]。

在本研究中根據(jù)對(duì)HP-PRRSV HuN4株GP3的氨基酸序列進(jìn)行抗原性、親水性、疏水性等分析,去除了其位于N端的(1 aa～49 aa)一部分疏水性區(qū)域,然后對(duì)其進(jìn)行了融合表達(dá)。從表達(dá)產(chǎn)物的Western blot反應(yīng)結(jié)果來看,去除其疏水性區(qū)域?qū)υ摰鞍椎姆磻?yīng)活性沒有造成影響,這與蔣文明等[10]、劉金霞等[11]的研究結(jié)果一致。

因?yàn)镠P-PRRSV變異株與經(jīng)典株在進(jìn)化樹中位于不同的分支中[12],所以現(xiàn)地使用的來自于經(jīng)典毒株的疫苗對(duì)于高致病性PRRSV可能起不到理想的免疫保護(hù)效果,因此需要利用HP-PRRSV來開發(fā)新型疫苗。有研究發(fā)現(xiàn)GP3可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體并能中和病毒,而且針對(duì)GP3的抗體無抗體依賴性增強(qiáng)作用[4]。Plana D J等[13]用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)GP3,該蛋白免疫接種后能夠保護(hù)豬不受PRRSV感染,保護(hù)率達(dá)到68.4%。因此,GP3可作為開發(fā)基因工程疫苗的候選抗原,深入研究GP3的免疫特性及其相應(yīng)功能具有一定的理論意義和實(shí)踐意義?？傊?本研究利用大腸埃希菌成功表達(dá)HPPRRSV HuN4株GP3,并證明該蛋白具有良好的免疫原性,為進(jìn)一步研究GP3的結(jié)構(gòu)、功能以及研制新型PRRSV診斷試劑和基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

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Prokaryotic Expression of Highly Pathogenic PRRSV ORF3 Gene

XU Ming-ming1,2,LIU Yong-gang2,WANG Shu-jie2,WU Jia-nan2,SHI Wen-da2,LI Li-qin2,RONG Fu-long1,2,CAI Xue-hui2

(1.Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang,150001,China;2.Division of Swine Inf ectious Diseases,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin,Heilongjiang,150001,China)

To further study the structure,function and immunogenicity of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)GP3.A pair of primers for ORF3 gene of PRRSV were designed according to the PRRSV(HuN4 strain)sequence available in GenBank.The ORF3 gene of PRRSV was cloned into the expression vector pProEx H Tb and the recombinant plasmid was transformed intoE.colicompetent cells BL21.Expression of fusion protein inE.coliwas observed by Western blot.The purified GP3 was inoculated into Balb/c mice to prepare anti-GP3 serum,the specificity and titer of the antiserum were evaluated by ELISA.Specific high titer antibodies were detected in the vaccinated mice.The results showed that the GP3 expressed inE.colicould induce high antibody titer against GP3,and had strong antigenicity.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus;ORF3 gene;prokaryotic expression;antigenicity

S852.659.6;S858.28

A

1007-5038(2010)08-0008-04

2010-01-15

資金項(xiàng)目:十一五國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD06A07)

徐明明(1984-),女,黑龍江安達(dá)人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物病毒分子免疫學(xué)研究。*通訊作者