李懷鳳 彭清華 姚小磊 王 方 陳佳文 吳權(quán)龍 李傳課 李 點 朱惠安

近年來研究表明基于免疫的炎癥反應(yīng)是各種類型干眼癥發(fā)病的共同機制，淚腺及眼表的炎癥可導(dǎo)致淚腺及眼表上皮細(xì)胞損傷及凋亡、淚液中水樣液及粘液的分泌減少。研究去勢雄鼠干眼癥眼表面炎癥反應(yīng)與干眼癥病因之間的關(guān)系是研究干眼癥發(fā)病機制的關(guān)鍵。本研究通過制作去勢雄鼠干眼癥模型，觀察干眼癥各組角膜和淚腺光鏡及淚腺電鏡超微組織結(jié)構(gòu)的變化，為其發(fā)病機制和治療方法提供事實依據(jù)；并通過密蒙花總黃酮對其進(jìn)行干預(yù)，探討其防治干眼癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康1月齡雄性Wistar大鼠150只（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），體重100g左右，常規(guī)喂養(yǎng)。 隨機分為 A1、B1、C1、D1、E1、A2、B2、C2、D2、E2、A3、B3、C3、D3、E3共 15 組，每組 10 只。 分別為：A：正常組；B：假手術(shù)對照組；C：手術(shù)對照（去勢）組；D：雄激素治療組對照；E：密蒙花總黃酮治療組；1代表飼養(yǎng)1個月后；2為飼養(yǎng)3個月后；3為飼養(yǎng)5個月后。

1.2 實驗動物模型制作參照有關(guān)文獻(xiàn)〔1〕

將實驗鼠切除雙側(cè)睪丸及附睪；假手術(shù)組只切開陰囊而不切除睪丸，正常組不做任何處理。

1.3 主要藥品和試劑

密蒙花（產(chǎn)于湖南邵陽）：密蒙花干藥材由湖南九匯現(xiàn)代中藥有限公司提供，其總黃酮制備由該課題組博士在湖南省植物提取工程提取中心完成 （密蒙花藥材中蒙花苷含量為0.85%,提取成品中蒙花苷含量約17%，蒙花苷中總黃酮含量>80%）；丙酸睪酮注射液（25mg/ml，市售）：天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)；Leica石蠟切片機：德國Leica公司生產(chǎn)；Hitachi h-600型透射電子顯微鏡：日本日立公司生產(chǎn)。

1.4 給藥方法

各組在造模后1周，待傷口基本愈合后開始用藥。雄激素治療組丙酸睪酮注射液以1∶4麻油稀釋后按0.5ml/kg大腿肌肉注射，1次/3d；密蒙花總黃酮治療組以1%密蒙花提取物生理鹽水混懸液5ml/kg灌胃，1次/天；其余3組以0.9%生理鹽水5ml/kg灌胃，1 次/天。

1.5 干眼癥大鼠模型的檢查方法

檢查均由同一人完成，每次檢查時間、地點、照明亮度、濕度及溫度相同。 參照有關(guān)文獻(xiàn)〔2，3〕，各組動物分別于 1、3、5 個月后，行淚膜破裂時間（BUT）、角膜熒光素染色檢查及Schirmer I試驗。BUT：用玻璃棒蘸2%熒光素鈉在下瞼結(jié)膜囊內(nèi)涂抹，使眼瞼閉合熒光素均勻分布于角膜表面后，固定其上下瞼使角膜充分暴露，于裂隙燈下用鈷藍(lán)光照射觀察，從最后一次瞬目開始計時，記錄淚膜上出現(xiàn)第一個破裂點的時間。角膜熒光素染色：玻璃棒蘸熒光素涂抹于下瞼結(jié)膜囊，裂隙燈下觀察，將角膜分為4個象限〔4〕，0 級:無染色（－），1 級:散在點狀染色（＋），2 級:密集型點狀染色（++），3 級:片狀染色（+++）。Schirmer I試驗〔5〕：用 2.5mm×35mm 淚液檢測濾紙條，將一端折彎5mm，置于下瞼內(nèi)側(cè)1/3結(jié)膜囊內(nèi)，其余部分懸垂于皮膚表面。閉眼5分鐘后測量濾紙濕潤長度（不包括反折）。

1.6 標(biāo)本采集

1、3、5 個月后各組隨機抽取10只大鼠，20%烏拉坦全身麻醉后斷頭法處死各組動物，即刻摘取雙眼淚腺、角膜組織，4%多聚甲醛固定準(zhǔn)備，HE染色，光鏡觀察各組織結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS15.0系統(tǒng)軟件處理。計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。若滿足正態(tài)性和方差齊性，則用多因素方差分析兩兩比較法；不滿足正態(tài)性和方差齊性時，則用非參多重比較法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干眼癥的傳統(tǒng)檢查結(jié)果

2.1.1 角膜熒光素染色：A、B組角膜熒光素染色無明顯改變；C組大鼠喂養(yǎng)3個月后，角膜上皮開始進(jìn)行性缺損，熒光素染色呈陽性，且隨時間加重；D、E組于去勢治療3、5個月后見角膜熒光素染色，染色點較C組減少（表1）。

表1 各組鼠角膜熒光素染色的比較

2.1.2 Shirmer實驗：同一組別不同時間段的比較：A組、B組、D組各時間段比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；C組3、5個月與1個月比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；C組 3、5個月時比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；E組3個月與1個月比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；E組5個月與1個月比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

同一時期不同組別的比較：1個月后，A、B、C、D、E 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3 個月后，A、B、C、D、E 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B、D 組與 A 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；A、D、E 與 C 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；D與E組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；5 個月后，B、D 組與 A 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；D、E組與C組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；D 組與 E 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05,表 2）。

表2 各組鼠Shirmer實驗試紙長度測定的比較（±s，mm）

表2 各組鼠Shirmer實驗試紙長度測定的比較（±s，mm）

注：采用非參多重比較法（Games-Howell）組間 F=7.982，組內(nèi)F=10.949。①A組與B組比較P=0.997,②2組與3組比較P=0.47。

分組 N 1（1個月） 2（3個月） 3（5個月）A B C D E 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 6.4±1.0 6①6.3±1.1 2①7.2±1.3 0 6.0±1.1 7 5.8±1.0 2 6.3±1.1 2①②6.2±1.5 1①②4.0±0.8 4②6.1±0.5 3②5.4±0.4 4②6.2±1.1 0①②6.1±1.2 4①②3.6±0.6 1②5.8±0.3 8②4.8±0.4 7②

2.1.3 淚膜破裂時間（BUT）：同一組別不同時間段的比較：A、B組各時間段差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；C組1個月、3個月、5個月相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；D組 1、3個月比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），5 個月與 1、3 個月比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；E組 1、3及 5個月比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

同一時期不同組別的比較：A、B組在各時間段差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；1 個月后，A、B、C、D、E 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；C2、E2與 A2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；3個月后，D、E 組與C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；D與E組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；5 個月后，C、D、E 與 A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；D、E與C組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；D與E組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05,表 3）。

表3 各組鼠淚膜破裂時間（BUT）測定的比較（±s，秒）

表3 各組鼠淚膜破裂時間（BUT）測定的比較（±s，秒）

注：采用多因素方差分析的兩兩比較（LDS法）組間F=15.295，組內(nèi)F=19.895。*A組與B組比較P=1。

分組 N 1（1個月） 2（3個月） 3（5個月）A B C D E 10 10 10 10 10 12.0±2.22*11.5±2.33*11.0±2.59 11.4±2.32 11.8±1.13 12.0±2.69*12.0±2.72*8.0±1.50 11.0±1.45 10.0±2.01 11.0±1.91*11.5±2.04*5.0±1.06 9.0±1.35 8.0±1.11

2.2 角膜及淚腺的光鏡觀察

2.2.1 正常對照組（A組）:角膜:上皮層、前彈力膜、基質(zhì)層、后彈力膜和內(nèi)皮層清晰可見，上皮層光滑完整?；|(zhì)層內(nèi)見少量角膜細(xì)胞（圖1）。淚腺:表面有薄層結(jié)締組織被隔，結(jié)締組織深入實質(zhì)將腺組織分成大小不等的小葉。小葉及腺泡間可見散在的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及漿細(xì)胞。腺泡大小均勻，排列緊密（圖 2）。

2.2.2 假手術(shù)對照組（B組）:角膜和淚腺：光鏡下所見基本同正常組。

2.2.3 手術(shù)模型組（C組）:角膜:與正常組相比，C1組：上皮層細(xì)胞層次增加，局部扁平細(xì)胞見不規(guī)則少量脫失（圖3）；C2組：上皮層細(xì)胞層次增加，扁平細(xì)胞見不規(guī)則片狀脫失（圖4）；C3組：上皮層細(xì)胞層次增加，表層扁平細(xì)胞不規(guī)則缺失，翼狀細(xì)胞外露；基質(zhì)層水腫增厚，其內(nèi)細(xì)胞成分增多，見大量炎性細(xì)胞浸潤（圖5）。淚腺:與正常組淚腺相比，C1組：腺泡內(nèi)分泌泡有所增多（圖6）；C2組：腺泡內(nèi)及腺泡細(xì)胞內(nèi)分泌物增多，見細(xì)胞核分裂相（圖7）；C3組：淚腺腺泡密集，排列規(guī)則，腺泡細(xì)胞內(nèi)仍見大量分泌顆粒，腺泡間結(jié)締組織內(nèi)見細(xì)胞成分增多，見分葉核及單核細(xì)胞浸潤（圖8）。

2.2.4 雄激素治療對照組（D組）：角膜:與正常組相比，D1組：結(jié)構(gòu)基本同正常組淚腺；D2組：上皮層細(xì)胞層次增加，局部扁平細(xì)胞見不規(guī)則少量脫失；D3組：上皮層細(xì)胞層次增加，扁平細(xì)胞見不規(guī)則片狀脫失。淚腺:與正常組淚腺相比，D1組：基本同正常組淚腺；D2組：腺泡內(nèi)分泌泡有所增多；D3組：腺泡內(nèi)及腺泡細(xì)胞內(nèi)分泌物增多，見細(xì)胞核分裂相。

2.2.5 密蒙花總黃酮治療組（E組）

角膜和淚腺光鏡與D組基本相同（圖9、10）。

2.3 淚腺的透射電鏡觀察

正常對照組（A組）透射電鏡觀察：可見淚腺細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)清楚，核膜完整，核仁明顯，腺上皮細(xì)胞間有緊密連接，細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富、分泌面有大量分泌泡，細(xì)胞表面有微絨毛結(jié)構(gòu)（圖11）。

假手術(shù)對照組（B組）透射電鏡觀察：所見基本同正常組淚腺。

手術(shù)模型組（C組）透射電鏡觀察：C1組：所見結(jié)構(gòu)基本同正常組淚腺（圖12）；C2組：核膜皺縮，有局灶變性壞死 （溶酶體呈黑洞狀），線粒體腫脹 （圖13）；C3組：腺泡排列規(guī)則，每個腺泡中央見腺泡腔，腺泡細(xì)胞內(nèi)上部可見大量分泌顆粒，腺泡細(xì)胞基底部見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高而基體；線粒體空泡化；腺泡細(xì)胞之間可見緊密連接；腺泡間結(jié)締組織內(nèi)見少量小靜脈、毛細(xì)血管及巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，核膜皺縮，有局灶變性壞死（溶酶體呈黑洞狀），線粒體腫脹，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞邊壞死狀，局灶凋亡壞死，凋亡明顯（核固縮，染色質(zhì)邊集）（圖14）。

雄激素治療對照組 （D組）透射電鏡觀察：D1組：空泡改變（或有類脂滴樣空泡改變），細(xì)胞間隙增寬；D2組：管腔微絨毛有脫落，線粒體嵴丟失，有空泡樣變，管腔有局灶性病變，線粒體腫脹，有脂滴樣變，核固縮，凋亡相對明顯，血管及內(nèi)皮變化不大；D3組：線粒體輕腫脹，核輕腫脹，局灶水腫變性，疑核壞死，有包涵體結(jié)構(gòu)。

密蒙花總黃酮治療組（E組）透射電鏡觀察：E1組：線粒體腫脹，空泡變明顯。E2組：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相對豐富，染色質(zhì)邊集。E3組：線粒體腫脹減輕，丟失或成空泡變（圖 15）。

3 討論

近年來多項研究結(jié)果均顯示：隨著年齡的增加，干眼的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢，其中女性更明顯〔6〕。干眼的動物模型也已經(jīng)幫助我們證實了雄激素在促進(jìn)淚液分泌功能方面的作用。雄激素水平的降低可通過其上的受體降低而加重干眼癥患者角膜和淚腺的損害，從而加重干眼的眼表損害。

本研究以此為依據(jù)制作了去勢雄鼠干眼癥動物模型，手術(shù)切除雄鼠雙側(cè)睪丸，結(jié)果3個月后發(fā)現(xiàn)去勢雄組鼠角膜熒光素染色呈點狀。運用傳統(tǒng)的檢查方法對去勢雄鼠的眼表情況進(jìn)行檢查發(fā)現(xiàn)，去勢組雄鼠5個月后Schirmer I實驗、淚膜破裂時間（BUT）明顯小于正常對照組，且隨觀察時間延長差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明雄激素水平下降后可導(dǎo)致模型動物淚液分泌減少、淚膜穩(wěn)定性下降、角膜表面染色，可診斷為干眼癥。

本實驗自大鼠造模1周后開始用藥，在傳統(tǒng)檢查方面，密蒙花總黃酮治療組3、5個月后，角膜熒光素染色明顯比去勢組減輕，與雄激素治療的對照組無明顯差別；SIT檢查在3個月后,密蒙花總黃酮治療組淚液浸濕濾紙長度明顯長于去勢組 （P＜0.01），與雄激素治療組療效差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；5個月后，密蒙花總黃酮治療組明顯優(yōu)于去勢組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與雄激素治療組相比療效稍差（P＜0.05）；BUT 檢查在用藥 3、5 個月后，密蒙花總黃酮治療組淚膜破裂時間長于去勢組，與雄激素治療組無明顯差別。

密蒙花為馬錢科落葉灌木密蒙花樹的花蕾，其味甘，性微寒，歸肝經(jīng)。有清熱（瀉火）養(yǎng)肝，明目退翳之功效。主治目赤翳障，目昏干澀等癥。密蒙花提取物因其有高含量的黃酮類物質(zhì)，一方面它能夠與雌激素受體（ER）結(jié)合產(chǎn)生擬雌激素活性作用；另一方面還能間接或可能直接產(chǎn)生擬雄激素活性作用〔9〕。近期研究表明：密蒙花黃酮類提取物對干眼癥有良好的治療效果，其機制主要與密蒙花黃酮能夠有效調(diào)節(jié)淚腺局部炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)，能改善淚腺超微結(jié)構(gòu)，從而維持淚液基礎(chǔ)分泌量〔10，11〕。

本實驗，光鏡觀察下見密蒙花總黃酮治療組可以減輕去勢導(dǎo)致的角膜和淚腺炎癥浸潤和細(xì)胞壞死脫落，與雄激素治療組無差別。電鏡觀察淚腺超微結(jié)構(gòu)見淚腺細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改變輕微，顯示其對去勢所致干眼癥淚腺和角膜有一定的保護作用。密蒙花總黃酮在治療去勢雄鼠干眼癥動物模型上有顯著療效，減輕了去勢雄鼠逐漸加重的淚腺分泌功能損害，延緩了去勢雄鼠淚腺超微結(jié)構(gòu)等病理學(xué)改變。

總之，在去勢雄鼠干眼癥發(fā)病過程中，淚腺分泌功能損害，淚液量和質(zhì)的改變導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降、角膜上皮缺損，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致干眼癥的發(fā)生和發(fā)展。密蒙花總黃酮在治療去勢雄鼠干眼癥動物模型上有較好療效，而且減輕了去勢雄鼠逐漸加重的淚腺分泌功能和角膜上皮的損害，這可能是其治療干眼癥的關(guān)鍵機制之一。

圖1 正常對照組角膜HE染色×400。圖2正常對照組淚腺HE染色×400。圖3去勢組雄鼠1個月角膜HE染色×400。圖4去勢組雄鼠3個月角膜HE染色×400。圖5去勢組雄鼠5個月角膜HE染色×400。圖6去勢組雄鼠1個月淚腺HE染色×400。圖7去勢組雄鼠3個月淚腺HE染色×400。圖8去勢組雄鼠5個月淚腺HE染色×400。圖9密蒙花總黃酮治療組5個月角膜HE染色×400。圖10密蒙花總黃酮治療組5個月淚腺HE染色×400。圖11正常對照組淚腺透射電鏡×8K。圖12去勢組雄鼠1個月淚腺透射電鏡×12K。圖13去勢組雄鼠3個月淚腺透射電鏡×8K。圖14去勢組雄鼠5個月淚腺透射電鏡×8K。圖15密蒙花總黃酮治療組5個月淚腺透射電鏡×8K。

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