張微思，羅孝坤，張麗英，張利菁，朱 萍

（中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

松茸 （Tricholoma matsutake），學(xué)名松口蘑，別名有大花菌、松菌、剝皮菌等，在日本有 “蘑菇之王”之稱，也是珍稀瀕危的食用兼藥用菌[1]。目前，云南松茸的發(fā)展和可持續(xù)利用形勢不容樂觀，科學(xué)家們正在研究松茸的半人工栽培和人工栽培方法以拯救這一珍貴食用菌，為民造福和創(chuàng)收[2]。松茸菌絲體的純培養(yǎng)是進(jìn)行松茸半人工栽培和人工栽培的前提條件[3，4]。由于松茸是活體共生菌,菌種的分離和培養(yǎng)十分困難，因此有必要對培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定，保證通過菌絲體純培養(yǎng)得到的培養(yǎng)種與原種在種質(zhì)上是一致的[5-7]。通過對云南4個(gè)不同地方的松茸進(jìn)行組織分離，獲得了斜面培養(yǎng)的母種及液體培養(yǎng)的擴(kuò)繁種，并通過感官和分子鑒定，證明了所培養(yǎng)菌絲與原子實(shí)體的種質(zhì)一致性，為松茸菌絲體的進(jìn)一步發(fā)展及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)材料

原種來源于4個(gè)不同地點(diǎn)采集的松茸，見表1。

1.2 主要儀器

培養(yǎng)皿、接種針、離心機(jī)、水浴鍋、電泳儀、電泳槽、PCR儀、紫外分光光度儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)、各型號微量移液器、高壓滅菌鍋等。

表1 采集松茸子實(shí)體的4個(gè)樣點(diǎn)

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌絲體的培養(yǎng)

原種菌絲體的分離及培養(yǎng)，用PDA綜合培養(yǎng)基+0.5%酵母膏斜面培養(yǎng)基及組織分離法進(jìn)行培養(yǎng)[9，10]。將上述經(jīng)斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)成功的菌絲體接入到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行菌絲體擴(kuò)繁。

1.3.2 原種與培養(yǎng)種的ITS分子鑒定

松茸DNA的提取采用改良的CTAB法，溶液的配制參照Clark（1998）的方法。反應(yīng)體系：總體積為20 μL，Mg2+2.5 mmol·L－1， Buffer1× ， dNTP 0.3 mmol·L－1， 引 物0.25 mmol·L－1， 模板 1 ng·μL－1～80 ng·μL－1， Taq DNA 聚合酶 1 U。 擴(kuò)增程序： 94℃ 5 min； 94℃ 30 s， 50℃～54℃ 45 s，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。所用到的引物的序列如下：ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，ITS5(GGAAGTAA AAGTCGTAACAAGG)。 擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)入含 0.5 μg·mL－1溴化乙錠的 1.8%瓊脂糖凝膠中， 以 DL2000 做Marker，用1×TAE緩沖液，DYY－33B型電泳槽，電壓45 V·cm－1，電泳3 h，于紫外檢測儀下觀察并照相，目的片段用WATSON膠回收試劑盒回收并純化DNA，用ABI DNA3700分析儀測序。獲得的序列用NCBI的BLAST進(jìn)行序列搜索，用DNAStar CLUSTALX等軟件進(jìn)行序列比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 原種菌絲體

原種菌絲體的獲得，見表2。

表2 斜面培養(yǎng)基上菌絲體的生長狀況

由表2可以看出，取自4個(gè)地點(diǎn)的松茸子實(shí)體利用組織分離法，培養(yǎng)7 d～10 d后，組織塊開始萌動(dòng)，可見組織塊的表面發(fā)白，長出白色的菌絲體，菌絲能緊貼著培養(yǎng)基生長，生長速度非常緩慢。因此，利用PDA綜合培養(yǎng)基+0.5%酵母膏這種培養(yǎng)基能夠較好地培養(yǎng)出實(shí)驗(yàn)所需的菌絲體。

2.2 菌絲的擴(kuò)繁

菌絲的擴(kuò)繁情況，見表3和圖1。

由表3和圖1可以看出，利用液體培養(yǎng)基配方可以較好地對松茸的菌絲體進(jìn)行擴(kuò)繁，且菌絲體生長良好。

2.3 ITS擴(kuò)增

ITS擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠分析結(jié)果，見圖2。

由圖2可以看出，經(jīng)PCR擴(kuò)增后8個(gè)樣品皆得到1條約650 bp左右的條帶，而且條帶清晰明亮無雜帶。

2.4 4個(gè)原種與培養(yǎng)種的ITS序列比較

表3 松茸菌絲體在液體培養(yǎng)基中的生長過程

4個(gè)原種與培養(yǎng)種的ITS序列比較情況見圖3。

由圖3可得，PⅠ和PⅠ1的ITS測序結(jié)果基本相同。在670多個(gè)堿基中它們之間只存在5個(gè)堿基位點(diǎn)不同，并且出現(xiàn)變異的堿基主要處于序列末端。所以可以說培養(yǎng)種即是原種。PⅡ和PⅡ2的ITS測序結(jié)果完全相同，PⅢ和PⅢ1的ITS測序結(jié)果基本相同，PⅣ和PⅣ3的ITS測序結(jié)果基本相同，可以判定培養(yǎng)種即是原種。

圖1 松茸菌絲體液體培養(yǎng)情況

圖2 ITS擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠圖

圖3 PⅠ和PⅠ1的ITS序列圖

2.5 培養(yǎng)種和原種的ITS序列差異度比較

培養(yǎng)種和原種的ITS序列差異度比較情況見表4。

表4 原種與培養(yǎng)種的ITS序列差異度

從表4可以看出，PⅠ和PⅠ1序列差異度為0.003，相似度為 0.997；PⅡ和PⅡ2序列的差異度為0，相似度為 1；PⅢ和 PⅢ1序列的差異度為 0.002，相似度為0.998；PⅣ和 PⅣ3序列差異度為0.002，相似度為0.998。由于差異度＜0.01，證明上述原種與培養(yǎng)種在分類上屬于同一個(gè)種。

2.6 4個(gè)培養(yǎng)種和原種的進(jìn)化樹關(guān)系

4個(gè)培養(yǎng)種和原種的進(jìn)化樹關(guān)系見圖4。

圖4 原種和培養(yǎng)種的進(jìn)化樹圖

由圖4進(jìn)化樹可得，在4個(gè)原種中，PⅠ和PⅡ在進(jìn)化樹上處于一個(gè)分支，PⅢ和PⅣ的在進(jìn)化樹上處于另一個(gè)分支。同時(shí)也可看出原種與其相應(yīng)的培養(yǎng)種在進(jìn)化距離上是最近的，也即它們屬于同一個(gè)種，和實(shí)驗(yàn)的預(yù)期結(jié)果相吻合。

3 討論

實(shí)驗(yàn)通過對松茸菌絲體的獲得、擴(kuò)繁及其鑒定，證實(shí)了在合理控制實(shí)驗(yàn)條件下，可以進(jìn)行松茸菌絲體液體擴(kuò)繁，且擴(kuò)繁后的菌絲體與原種依然保持種質(zhì)的一致性，對利用液體培養(yǎng)出的培養(yǎng)物仍需要進(jìn)行種質(zhì)的鑒定。本文又采用了ITS分子鑒定的方法，對原種和培養(yǎng)種進(jìn)行了遺傳分子的鑒定，從分子水平上說明了其在遺傳種質(zhì)上的一致性，為今后的大規(guī)模培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。

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