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        HPLC同時(shí)測(cè)定苦參不同年份、不同部位中3個(gè)生物堿的含量

        2010-05-26 06:14:40徐石穩(wěn)楊小生靳如義
        中成藥 2010年5期
        關(guān)鍵詞:三氯甲烷苦參堿苦參

        徐石穩(wěn), 楊小生,*, 靳如義, 馬 琳

        (1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550002;2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550002;3.貴陽(yáng)新天藥業(yè)股份有限公司,貴州貴陽(yáng) 550018)

        苦參(Sophora flavescensAit.)系豆科植物苦參的干燥根,具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功能。用作苦味健胃劑、利尿劑、消炎藥、止瀉藥和驅(qū)蟲藥。其制劑苦參凝膠系國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局2005年批準(zhǔn)上市的新藥,它由原料藥苦參總堿與基質(zhì)卡波姆940等輔料經(jīng)現(xiàn)代工藝加工成的棕色透明膠凍狀半固體水溶性凝膠,具抗菌消炎之功效,用于宮頸糜爛、赤白帶下和滴蟲性陰道炎及陰道霉菌感染等婦科慢性炎癥[1]??鄥⒃趥鹘y(tǒng)中藥中以根作為入藥部位,苦參的地上部分,也稱為苦參草為貴州少數(shù)民族用藥[2]。文獻(xiàn)報(bào)道,苦參蘆頭(根莖)和根均含有苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿[3],我們的前期工作也獲得了結(jié)果。對(duì)苦參生物堿在苦參不同部位高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定方法尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用HPLC同時(shí)測(cè)定了苦參不同年份、不同部位中槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿的的含量,該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。槐果堿在莖葉中含量最高,槐定堿和氧化苦參堿的含量在根中最高,且3種生物堿成分均隨年份的增長(zhǎng)含量呈上升的趨勢(shì),氧化苦參堿在根中的變化尤為明顯。研究結(jié)果對(duì)苦參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及苦參全草的有效開發(fā)利用具有重要的參考價(jià)值。

        1 儀器與材料

        儀器HP1100型高效液相色譜儀 (在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測(cè)器,ChemStation色譜工作站)。

        槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿對(duì)照品自制,通過(guò)MS、NMR鑒定其結(jié)構(gòu),并經(jīng)HPLC檢測(cè)純度大于98%。乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。苦參藥材采自貴陽(yáng)新天藥業(yè)羊昌苦參藥材基地。結(jié)構(gòu)鑒定如下:

        化合物1:白色晶體(丙酮),mp 55~57℃。EIMS m/z:246[M+],245(M-1),217,203,177,150,122,96。1H-NMR(CDCl3,400 MHz,下同)δ:6.47(1H,ddd,J=9.8,5.0,3.8 Hz H-13),5.81(1H,d,J=10.0 Hz,H-14),4.13(1H,dd,J=13.2,4.8 Hz,H-17a),3.98(1H,q,H-11),3.19(1H,t,J=13.2 Hz,H-17β),2.85(2H,m,H-2β,10β),2.62(1H,m,H-6)。13C-NMR(CDCl3,100 MHz,下同)δ:57.1(C-2),20.8(C-3),27.1(C-4),34.4(C-5),63.4(C-6),41.2(C-7),26.3(C-8),20.5(C-9),57.1(C-10),51.3(C-11),27.5(C-12),137.4(C-13),124.4(C-14),165.5(C-15),41.8(C-17)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[4-7]報(bào)道一致,確定該化合物為槐果堿(sophocarpine)。

        化合物2:白色晶體(丙酮),mp 102~103℃。EI-MS m/z:248[M+],247(M-1),233,219,205,192,177,162,150,136,122,110,96,83,69,55,41。1H-NMR(CDCl3)δ:3.30 ~3.46(3H,m,H-11,17),2.78-2.89(2H,m,H-2,10a),2.16 ~2.40(H-2,10β,14)。13C-NMR(CDCl3)δ:55.6(C-2),21.4(C-3),23.5(C-4),30.7(C-5),63.2(C-6),40.8(C-7),30.1(C-8),21.6(C-9),50.2(C-10),55.8(C-11),28.0(C-12),18.8(C-13),32.4(C-14),170.0(C-15),47.5(C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6,8]報(bào)道一致,確定其結(jié)構(gòu)為槐定堿(sophoridine)。

        化合物3:白色晶體(丙酮),mp 210~211℃。EI-MS m/z:264 [M+],248,247,231,218,205,190,176,162,150,138,120,108,96,84,68,55,41。1H-NMR(CDCl3)δ:5.08(1H,dt,J=8.8,3.6 Hz,H-11),4.36(1H,dd,J=12.4,5.2 Hz,H-17β),4.18(1H,t,J=12.4 Hz,H-17α),3.06(5H,m,H-2α,2β,6,10α,10β),2.75(2H,m,H-3β,9β),2.41(1H,m,H-14β),2.22(2H,m,H-14α,H-12β),2.11(1H,m,H-8β)。13C-NMR(CDCl3)δ:69.3(C-2),17.2(C-3),26.1(C-4),34.5(C-5),67.3(C-6),42.7(C-7),24.8(C-8),17.3(C-9),69.6(C-10),53.0(C-11),28.5(C-12),18.7(C-13),32.9(C-14),170.3(C-15),41.9(C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5,7,9]一致,確定其結(jié)構(gòu)為氧化苦參堿(oxymatrine)。

        2 方法和結(jié)果

        2.1 色譜條件 色譜柱:大連依利特分析儀器有限公司 Hypersil NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:26℃;流動(dòng)相:乙腈-3%磷酸溶液-無(wú)水乙醇(82 ∶8 ∶10);流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm。按上述色譜條件獲得對(duì)照品和樣品的色譜圖(見圖1)。

        2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿,用乙腈-無(wú)水乙醇(80∶20)制成槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿濃度分別為0.009 98、0.050 15、0.150 75 mg/mL 的溶液,作為對(duì)照品溶液。

        2.3 供試品溶液的制備 按中國(guó)藥典2005版一部的方法,取苦參樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩),同時(shí)另取本品粉末測(cè)定水分(2005版中國(guó)藥典一部水分測(cè)定第一法),精密稱定0.5 g,置具塞錐形瓶中,加濃氨水0.5 mL,精密加入三氯甲烷20 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率33 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5mL,通過(guò)中性氧化鋁柱(100~200目,5 g,內(nèi)徑1 cm),依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇(7∶3)各20 mL洗脫,收集全部洗脫液,回收溶劑至干,殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解,并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,即得[10]。

        2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 取混合對(duì)照品溶液,自動(dòng)進(jìn)樣0.5、1、3、5、7、9、11、13、15 μL,按上述色譜條件測(cè)定,記錄峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸,得回歸方程?;惫麎A:Y=1 021.837 1X-0.035 6,r=0.999 9;槐定堿:Y=448.016 8X-1.116 8,r=0.999 9;氧化苦參堿:Y=551.250 1X-1.368 6,r=0.999 9。結(jié)果表明槐果堿在進(jìn)樣質(zhì)量為0.004 99 ~0.149 7 μg,槐定堿在0.025 08 ~0.752 25 μg,氧化苦參堿在0.075 38 ~2.261 25 μg時(shí),與峰面積呈良好線性關(guān)系。

        2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積,計(jì)算。槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿RSD值分別為0.63%、0.95%、1.03%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

        2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取3年生莖葉的樣品,按2.3項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液,在同一色譜條件下測(cè)定。樣品中槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿的RSD分別為0.77%、0.67%、2.11%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

        2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿RSD分別為2.04%、2.05%、1.81%。結(jié)果表明,供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.8 回收率試驗(yàn) 取苦參對(duì)照品適量,精密稱定,加三氯甲烷溶解,制成槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿濃度分別為 0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.15 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。取已知含量的2年生苦參莖葉粉末6份各0.25 g,精密稱定,分別精密加入上述對(duì)照品溶液10 mL,置具塞錐形瓶中,加濃氨水0.5 mL,精密加入三氯甲烷10 mL,密塞,稱定重量,從“超聲處理……”起,按2.3項(xiàng)下方法制備所需溶液。依法測(cè)定,計(jì)算回收率?;惫麎A,槐定堿,氧化苦參堿的平均回收率分別為99.91%,99.26%,100.27%;RSD分別為1.11%,0.82%,2.18%。

        2.9 樣品測(cè)定 取不同年份,不同部位的苦參藥材,按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試液,按上述色譜條件測(cè)定,計(jì)算含量。結(jié)果見表1。

        圖1 對(duì)照品(A)和樣品(B)1.槐果堿 2.槐定堿 3.氧化苦參堿Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B)1.sophocarpine 2.sophoridine 3.oxymatrine

        表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.1 Result of content determination of samples

        3 討論

        3.1 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了流動(dòng)相乙腈-無(wú)水乙醇-3%磷酸溶液(80 ∶10 ∶10)[11]、(81 ∶10 ∶9)和(82∶10∶8)的分離情況,最后選擇乙腈-無(wú)水乙醇-3%磷酸溶液(82∶10∶8)為流動(dòng)相,能使不同年份、不同部位苦參莖葉、蘆頭和根中多個(gè)生物堿成分得到基線分離,此方法簡(jiǎn)便易行,重現(xiàn)性好。

        3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 不同年份、不同部位苦參莖葉、蘆頭和根中槐果堿的含量分布狀態(tài)為莖葉>根>蘆頭,槐定堿的含量分布狀態(tài)為根>莖葉>蘆頭,氧化苦參堿的含量分布狀態(tài)為根>蘆頭>莖葉,而且3種生物堿類成分均隨年份的增長(zhǎng)含量呈上升的趨勢(shì)。

        3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同年份,不同部位,3種生物堿的含量分布存在較大差異。由于苦參生長(zhǎng)周期長(zhǎng),產(chǎn)量有限,如果以獲得生物堿類成分為目的,可以考慮使用苦參莖葉和蘆頭作為入藥部位。其中可考慮將槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿作為苦參莖葉、蘆頭質(zhì)量控制指標(biāo)成分。本研究建立的HPLC法測(cè)定苦參莖葉、蘆頭的槐果堿、槐定堿和氧化苦參堿的方法簡(jiǎn)便、可靠,可用于苦參莖葉、蘆頭的含量測(cè)定。可考慮在傳統(tǒng)用藥的基礎(chǔ)上開發(fā)新的藥用部位。

        3.4 目前以苦參根作為苦參凝膠原料藥苦參總堿提取的來(lái)源,而大量的地上部分莖葉和蘆頭未被利用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示幾個(gè)有效成分的含量不低,特別是苦參蘆頭中生物堿的含量,可考慮將苦參莖葉和蘆頭作為苦參總堿加工提取的來(lái)源。

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