范永春

（江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇南京 210028）

乳欣安膠囊為本院中藥制劑產(chǎn)品，由淫羊藿、蛇床子、全蝎三味藥材組成。具有調(diào)理沖任，化瘀散結(jié)功效，適用于治療婦女沖任失調(diào)引起的乳腺增生等癥。本方前期質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)僅有簡(jiǎn)單的常規(guī)檢查，為了更好的控制該品種的內(nèi)在質(zhì)量，對(duì)方中蛇床子、全蝎藥材進(jìn)行了薄層色譜的鑒別，并對(duì)淫羊藿苷、蛇床子素進(jìn)行含量測(cè)定。方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀-Waters2996型PDA檢測(cè)器、Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）;KQ250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 淫羊藿苷、蛇床子素對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào):淫羊藿苷110737-200312;蛇床子素110822-200305）;全蝎對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所，供鑒別用，批號(hào):121044-200202）;乳欣安膠囊（江蘇省中醫(yī)藥研究院自制，規(guī)格:每粒 0.35 g，批號(hào):20080415、20080722、20081126）;乙腈（色譜純）;水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別試驗(yàn)

2.1.1 蛇床子薄層鑒別

取本品內(nèi)容物2 g，研細(xì)，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取蛇床子素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取蛇床子對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取按處方量同法制備的陰性對(duì)照品（不含蛇床子藥材），制備陰性對(duì)照液。吸取上述4種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60℃ ～90℃）-乙酸乙酯（3∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2.1.2 全蝎薄層鑒別

圖1 蛇床子的薄層色譜圖1－3.供試品 4.蛇床子對(duì)照藥材 5.蛇床子素對(duì)照品 6.陰性對(duì)照Fig.1 TLC chromatogram of Fructus Cnidium1-3.samples 4.Fructus Cnidium 5.osthole standard 6.negative sample

取本品內(nèi)容物4 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取全蝎對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取按處方量同法制備的陰性對(duì)照品（不含全蝎藥材），制備陰性對(duì)照液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）上層液為展開(kāi)劑，預(yù)平衡30 min，上行展開(kāi)，展距10 cm，取出，晾干，噴以1%茚三酮乙醇液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 全蝎的薄層色譜圖1－3.供試品 4、5.全蝎對(duì)照藥材 6.陰性對(duì)照Fig.2 TLC chromatogram of scorpion1-3.samples 4、5.scorpion 6.negative sample

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 淫羊藿苷的含量測(cè)定

2.2.1.1 色譜條件 色譜柱為Alltima C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈-水（29 ∶71）［1］;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃。理論塔板數(shù)應(yīng)不低5 000，在該色譜條件下，淫羊藿苷可與其它成分基線分離，陰性組分無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖3 淫羊藿對(duì)照品（A）、供試品（B）和陰性對(duì)照品（C）HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of icariine standard（A）、sample（B）and negative sample（C）

2.2.1.2 線性關(guān)系 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成61.7 μg/mL的溶液。精密吸取上述淫羊藿苷對(duì)照品溶液 1、2、4、6、8、10、12 μL，注人液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=2 128.7X－62 862，r=0.999 6，結(jié)果表明:進(jìn)樣量在61.7 ng～740.4 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.1.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約0.2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇［1］25 mL，密塞，稱定重量，放置 1 h，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取濾液，即得。

2.2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，按2.2.1.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，以峰面積計(jì)算RSD值為0.6%（n=6），結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 吸取同一供試品溶液，按2.2.1.1 項(xiàng)下的色譜條件，分別于 0、2、4、8、12、16 h時(shí)間間隔進(jìn)行分析，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算RSD值為1.1%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液制備后16 h內(nèi)測(cè)定，淫羊藿苷色譜峰面積無(wú)明顯變化，說(shuō)明在此時(shí)間內(nèi)，供試品溶液化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（20080722）樣品，按2.2.1.3項(xiàng)下方法，平行制備6份，按2.2.1.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，淫羊藿苷含量RSD=0.7%。說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

2.2.1.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批（20081126）樣品適量，共6份，定量加入淫羊藿苷對(duì)照品適量，按2.2.1.3項(xiàng)下操作，并按2.2.1.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，平均回收率為99.86%，RSD為0.82%，結(jié)果表明本方法回收率良好。見(jiàn)表1。

表1 淫羊藿苷回收率實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Recoverg test resultof icariine（n=6）

2.2.1.8 樣品測(cè)定 取3批（20080415、20080722、20081126）樣品，按2.2.1.3項(xiàng)下的方法操作，并按

2.2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，運(yùn)用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品（淫羊藿苷）含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.2 Determination results of samples（icariine）（n=3）

2.2.2 蛇床子素的含量測(cè)定

2.2.2.1 色譜條件 色譜柱為Alltima C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈-水（60 ∶40）［2］;檢測(cè)波長(zhǎng):322 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃。理論塔板數(shù)應(yīng)不低3 000［3］，在該色譜條件下，蛇床子素成分基線分離，陰性組分無(wú)干擾。見(jiàn)圖4。

2.2.2.2 線性關(guān)系 精密稱取蛇床子素對(duì)照品適量，加甲醇制成57.4 μg/mL的溶液。精密吸取上述蛇床子素對(duì)照品溶液 1、2、4、6、8、10、12 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=3 800.2X－69 746，r=0.999 8，結(jié)果表明:進(jìn)樣量在57.4 ng～688.8 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖4 蛇床子素對(duì)照品（A）、供試品（B）和陰性對(duì)照品（C）HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of osthole standard（A），sample（B）and negative sample（C）

2.2.2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約0.5 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇［4］25 mL，密塞，稱定重量，放置 1 h，超聲處理 30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取濾液，即得。

2.2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，按

2.2.2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，以峰面積計(jì)算RSD值為0.5%（n=6），結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 吸取同一供試品溶液，按

2.2.2.1 項(xiàng)下的色譜條件，分別于 0、2、4、8、12、16 h時(shí)間間隔進(jìn)行分析，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算RSD值為1.4%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液制備后16 h內(nèi)測(cè)定，蛇床子素色譜峰面積無(wú)明顯變化，說(shuō)明在此時(shí)間內(nèi)，供試品溶液化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（20080722）樣品，按2.2.2.3項(xiàng)下方法，平行制備6份，按2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，蛇床子素含量RSD=0.8%。說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

2.2.2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批（20081126）樣品適量，共6份，定量加入蛇床子素對(duì)照品適量，按2.2.2.3項(xiàng)下方法操作，并按2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，平均回收率為99.55%，RSD為0.71%，結(jié)果表明本方法回收率良好。見(jiàn)表3。

表3 蛇床子素回收率實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果（n=6）Tab.3 Recovery test result of osthole（n=6）

2.2.2.8 樣品測(cè)定 取3批（20080415、20080722、20081126）樣品，按2.2.2.3項(xiàng)下方法操作，并按

2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，運(yùn)用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品（蛇床子素）含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.4 Determination results of samples（osthole）（n=3）

3 討論

3.1 展開(kāi)劑的選擇 蛇床子定性鑒別時(shí)，曾采用苯-乙酸乙酯（30∶1）［5］和石油醚（60 ℃ ～90 ℃）-乙酸乙酯（3∶1）展開(kāi)，展開(kāi)效果均較理想，但考濾苯的毒性較大，故采用后者為展開(kāi)劑。

3.2 在定量測(cè)定初步試驗(yàn)時(shí)，取淫羊藿苷、蛇床子素對(duì)照品溶液分別在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果淫羊藿苷在270 nm處有最大吸收，蛇床子素在322 nm處有最大吸收，故分別采用270 nm、322 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 蛇床子素含量測(cè)定前，曾比較了甲醇-水（65∶35）、甲醇-水-冰醋酸（80 ∶20 ∶0.5）和乙腈-水（65∶35）、乙腈-水（60∶40）等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-水（60∶40）分離效果最好。

3.4 柱溫曾選擇20℃、30℃、35℃、40℃，結(jié)果表明在30℃時(shí)供試品分離度高，峰形較好。分析時(shí)間較短;故柱溫選用30℃。

［1］錢(qián)大瑋，鞠建明.乳康舒膠囊中活性物質(zhì)的測(cè)定［J］.中國(guó)新藥雜志，2004，13（11）:1024-1026.

［2］程愛(ài)平.高效液相色譜法測(cè)定滅菌王洗劑中蛇床子素的含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2005，14（3）:45.

［3］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:220.

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［5］焦志海，袁麗蘋(píng).婦寧洗液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志，2008，6（12）:1067-1071.