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        應(yīng)用高速逆流一次性分離川芎中的蛇床內(nèi)酯A和Z-蒿本內(nèi)酯

        2010-05-26 06:14:36吳平麗張繼全沈平孃
        中成藥 2010年5期
        關(guān)鍵詞:分配

        劉 雯, 吳平麗, 卓 超, 張繼全, 沈平孃*

        (1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院,上海 200237;2.國(guó)家中藥制藥工程技術(shù)研究中心,上海 201203)

        川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的根莖,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其性溫,味辛,微苦,具有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效。主治血瘀氣滯所致月經(jīng)不調(diào),痛經(jīng)經(jīng)閉,肝郁氣滯而致血行不暢的胸脅疼痛、頭痛、風(fēng)寒濕痹、跌打腫痛等。

        川芎揮發(fā)油含有多種苯酞化合物,其中Z-蒿本內(nèi)酯(Z-Ligustilide)含量最高,超過(guò) 1.0%[1],其次為蛇床內(nèi)酯A(Senkyunolide A)。據(jù)報(bào)道,蒿本內(nèi)酯與蛇床內(nèi)酯可以抑制血小板凝聚,松弛子宮、氣管與血管平滑肌,可用于治療咳嗽、月經(jīng)不調(diào)和高血壓等[2-3]。

        圖1 蛇床內(nèi)酯A和Z-蒿本內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)Fig.1 The construction of senkyunolide A and Z-ligustilide

        蒿本內(nèi)酯與蛇床內(nèi)酯結(jié)構(gòu)均極不穩(wěn)定,短時(shí)間內(nèi)即可轉(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)[4]。傳統(tǒng)的分離方法不適于蒿本內(nèi)酯的分離,雖然也有文獻(xiàn)報(bào)道用半制備高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳分離蒿本內(nèi)酯,但難以避免固相對(duì)分離物的吸附。

        高 速 逆 流 色 譜 (High-Speed Counter-Current Chromatography,HSCCC)是近幾十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的液-液色譜分離技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)不需要固相載體,只需要被分離物在兩相中分配,避免了固相載體帶來(lái)的大量樣品吸附、損失與污染等問(wèn)題,樣品回收率高,預(yù)處理及后處理都簡(jiǎn)便易行,已廣泛應(yīng)用于分離[5-6]。

        本研究應(yīng)用HSCCC一次性分離了Z-蒿本內(nèi)酯和蛇床內(nèi)酯A,取得了良好的分離效果。

        1 儀器與試劑

        TBE-300A型高速逆流色譜儀(上海同田生化有限公司),?KTA purifier P-900 泵,UV-900 紫外檢測(cè)器(GE Healthcare美國(guó)),HX-1050恒溫循環(huán)器(北京博醫(yī)康),Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent美國(guó))DAD檢測(cè)器,實(shí)驗(yàn)室超級(jí)純水器(上海賽鴿電子科技有限公司)。

        正己烷、乙酸乙酯、乙醇均為分析純,水為超純水,乙腈為色譜純。川芎藥材由上??禈蝻嬈邢薰咎峁?/p>

        2 分離試驗(yàn)用粗提物的制備

        稱(chēng)取川芎生藥材100 g,粉碎成細(xì)粉,加入600 mL乙醇,加熱回流提取,提取3次,每次2 h,過(guò)濾,減壓蒸干,得39 g棕黃色浸膏備用。

        3 溶劑體系分配系數(shù)的測(cè)定

        在溶劑系統(tǒng)的選擇中,樣品組分的分配系數(shù)的測(cè)定是相當(dāng)重要的準(zhǔn)備工作,分配系數(shù)是樣品組分在溶劑系統(tǒng)上下相中樣品組分在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)K接近于1(即0.2—3),即分配系數(shù)在此范圍內(nèi)時(shí)即可用來(lái)分離目標(biāo)產(chǎn)物,溶劑系統(tǒng)適合分離目標(biāo)成分。

        根據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道,選擇正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水溶劑系統(tǒng)為基礎(chǔ),進(jìn)行分配系數(shù)的篩選研究。

        稱(chēng)取浸膏1.0 g左右,共稱(chēng)取6份,放入20 mL的具塞試管中,按照表1中的溶劑體系,各配制10 mL,分層后,上下層各取2 mL加入到上面的試管中[8],給予充分的振蕩,搖勻后,再靜置分層,將各個(gè)溶劑體系的上下相分別蒸干,使用甲醇溶液定容到1 mL的量瓶中,經(jīng)過(guò)針式濾器過(guò)濾后,用高效液相色譜計(jì)算分配系數(shù)。

        4 高速逆流色譜分離試驗(yàn)過(guò)程

        根據(jù)分配系數(shù)測(cè)定的結(jié)果,兩相溶劑系統(tǒng)采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1∶1∶1∶1),臨用前分開(kāi)上下相,超聲30min。以溶劑系統(tǒng)的上相為固定相,下相為流動(dòng)相,以9 mL/min的流速將上相泵入管路,待固定相充滿(mǎn)整個(gè)管路后,停泵,啟動(dòng)主機(jī),把轉(zhuǎn)速調(diào)至892RPM,然后以1.2 mL/min的流速泵入流動(dòng)相。當(dāng)上下相平衡時(shí),記錄固定相流出的體積,計(jì)算得到固定相保留值0.53。供試品100 mg溶解于50 mL流動(dòng)相,濃度為10 mg/mL,進(jìn)樣量為10 mL,以1.2 mL/min的流速泵入流動(dòng)相。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,根據(jù)紫外檢測(cè)譜圖,收集各峰的組分,將各峰對(duì)應(yīng)的收集液分別濃縮,干燥。用HPLC及TLC檢測(cè)。

        5 結(jié)果

        5.1 分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果

        采用文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC[14]測(cè)定方法分析,溶劑體系的分配系數(shù)計(jì)算結(jié)果如表1。根據(jù)溶劑系統(tǒng)的選擇原則,選取3、5和6號(hào)體系進(jìn)行分離試驗(yàn)考察,結(jié)果表明,3號(hào)體系可以達(dá)到最佳分離效果。

        表1 樣品組分在各溶劑體系中分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 1 The K-value of different solvent system

        5.2 分離結(jié)果

        川芎粗品的HSCCC見(jiàn)圖2。進(jìn)樣60 min后開(kāi)始出峰,7 h內(nèi)出5個(gè)峰,分別對(duì)應(yīng)收集流出液。根據(jù)已有文獻(xiàn)的液相條件來(lái)初步確定成分,峰4為蛇床內(nèi)酯A,峰5為Z-蒿本內(nèi)酯。

        圖2 川芎高速逆流色譜技術(shù)分離結(jié)果Fig.2 The HSCCC result of the separation of Ligusticum chuanxiong Hort

        5.3 結(jié)構(gòu)鑒定

        5.3.1 核磁共振(NMR)對(duì)HSCCC分離峰的結(jié)構(gòu)分析

        Z-蒿本內(nèi)酯:1H-NMR(500 MHz,CDCl3,TMS)δppm:6.24(1 H,d,J=9.7,H-7),5.95(1 H,dt,J=9.5,4.4,H-6),5.20(1 H,t,J=7.6,H-8),2.60(2 H,m,H-4),2.42(2 H,m,H-5),2.38(2 H,m,H-9),1.48(2 H,tq,J=7.4,7.8 H-10),0.92(3 H,t,J=7.4,H-11)。以上數(shù)據(jù)與關(guān)于蒿本內(nèi)酯的文獻(xiàn)[9-10]一致。

        蛇床內(nèi)酯 A:1HNMR(CDCl3):1H-NMR(500 MHz,CDCl3,TMS)δppm:6.18(1 H,dt,J=9.6,2.0,H-7),5.92(1 H,dt,J=9.6,3.8,H-6),4.90(1 H,dd,J=7.7,3.8,H-3),2.48(2 H,m,H-4),2.48(2 H,m,H-5),1.9(1 H,m,H-8),1.45(1 H,m,H-8),1.3(2 H,m,H-9),1.3(2 H,m,H-10),0.9(3 H,t,J=7.1,H-11)。以上數(shù)據(jù)與關(guān)于蛇床內(nèi)酯 A的文獻(xiàn)[11-12]一致。

        5.3.2 EI-MS對(duì)HSCCC分離峰的結(jié)構(gòu)分析

        Z-Ligustilide:EI-MS:m/z190.1 [M+],161,148,134,105,77,55,Senkyunolide A:EI-MS:m/z192.1 [M+],163,135,133,105,79。以上數(shù)據(jù)與關(guān)于Z-蒿本內(nèi)酯及蛇床內(nèi)酯A的文獻(xiàn)[13]一致。5.3.3 HPLC對(duì)HSCCC分離峰的純度分析

        分別精密稱(chēng)量4號(hào)峰和5號(hào)峰干燥物質(zhì)3.1 mg、2.4 mg,用甲醇完全溶解,10 mL 定容,過(guò)濾,得供試品溶液。按照文獻(xiàn)[14]給出的高效液相色譜條件,進(jìn)樣量為 10 μL。

        根據(jù)面積歸一化法,并且與空白試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì),可以得到蛇床內(nèi)酯A的純度為99.3%,Z-蒿本內(nèi)酯的純度為97.7%。

        5.3.4 回收率的計(jì)算

        以分離得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的量與藥材中蛇床內(nèi)酯A和Z-蒿本內(nèi)酯實(shí)際測(cè)得藥材中含量之比,可計(jì)算得出蛇床內(nèi)酯A及Z-蒿本內(nèi)酯的回收率。計(jì)算可知,蛇床內(nèi)酯 A的回收率較高,可以達(dá)到96.61%,相比,Z-蒿本內(nèi)酯的回收率可以達(dá)到80.08%。

        6 討論

        使用高速逆流色譜技術(shù)分離出川芎揮發(fā)油中的兩個(gè)成分未見(jiàn)報(bào)道,我們首次使用此技術(shù),一次性完成兩個(gè)成分的分離及制備,得到兩個(gè)活性成分——蛇床內(nèi)酯A和Z-蒿本內(nèi)酯,并且純度均達(dá)到95%以上;蛇床內(nèi)酯的回收率為96.61%,Z-蒿本內(nèi)酯的回收率為80.08%,推測(cè)殘留一部分在固定相當(dāng)中。蛇床內(nèi)酯A與Z-蒿本內(nèi)酯的穩(wěn)定性差,使用普通的柱層析分離,耗時(shí)長(zhǎng),不易保存和純化;而半制備及制備型液相分離方法成本較高,均不適于快速、大量的制備分離Z-蒿本內(nèi)酯和蛇床內(nèi)酯A。而HSCCC分離過(guò)程短,避免傳統(tǒng)方法帶來(lái)的固相吸附,預(yù)處理簡(jiǎn)單,成本較低,成分得率高,后處理簡(jiǎn)便易行。說(shuō)明HSCCC對(duì)于分離穩(wěn)定性差的物質(zhì)具有較大優(yōu)勢(shì)。

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