丁志榮， 滕 亮*， 戴秀勇， 于富生

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830054;2.新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司，新疆烏魯木齊 830011）

去氫駱駝蓬堿（Harmine，HM）為β－咔保林類生物堿，廣泛存在于世界各地的多種天然植物中，在蒺藜科（Zygophyl laceae）植物駱駝蓬（Peganum harmalaL）的種子中含量較高且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［1］。駱駝蓬屬（Peganum）為蒺藜科（Zygophyl laceae）多年生草本植物，在我國作為民間藥或民族藥使用已有很長的歷史，資源豐富，蘊(yùn)藏量大，其種子中的化學(xué)成分主要為咔保啉類生物堿，如駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿［2］等，其中去氫駱駝蓬堿（Harmine，Har）含量最高。該生物堿具有抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛止癢［3］、抗原蟲及抗腫瘤等作用［4］。近年來國內(nèi)外對其抗腫瘤作用研究較多，但對其止癢等作用研究較少，同時(shí)因其本身嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用限制了它作為發(fā)揮全身作用的藥物品種的開發(fā)，因此本課題以外用鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏劑為研究對象，通過優(yōu)選乳膏劑處方工藝并對其止癢藥效學(xué)進(jìn)行研究達(dá)到拓寬其臨床應(yīng)用范圍、提高臨床用藥價(jià)值的目的［5］。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

鹽酸去氫駱駝蓬堿（Harmine HCl）:藥劑教研室提取精制（純度＞99%）;單硬脂酸甘油酯、蜂蠟、司盤－60、吐溫－80、氮酮、凡士林、甘油等均為藥用規(guī)格;皮炎平軟膏（三九醫(yī)藥股份有限公司，批號:0803301）;磷酸組胺（上海藍(lán)技科技發(fā)展有限公司，批號:080314）;五羥色胺（美國sigma公司，批號:028k5152）。

1.2 動(dòng)物

昆明種小鼠，♀♂各半，體重（20±2.0）g，新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.3 儀器

水浴鍋（上?，樮幵囼?yàn)設(shè)備有限公司），攪拌器（RW20.n），LVDVE旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)（美國博力飛公司），顯微鏡（上海第三光學(xué)儀器廠，XSP－4C），藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（重慶市永生實(shí)驗(yàn)儀器廠，SHH－250 SD）），離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠，LDZ4－0.8自動(dòng)平衡），分析天平（JM－5102浙江余兆紀(jì)銘稱重檢驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.4 材料

細(xì)砂紙;剪刀;1 mL注射器。

2 方法與結(jié)果

2.1 均勻試驗(yàn)優(yōu)選鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏處方組成

2.1.1 乳膏制備工藝［6］取單硬脂酸甘油酯、凡士林、蜂蠟、司盤－60、氮酮混合后，水浴加熱至80°C，另取 Harmine堿、甘油、吐溫－80混合后加蒸餾水溶解，水浴加熱至82°C。在攪拌狀況下將水相緩緩加入油相，不斷攪拌至室溫即得鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏。

2.1.2 評價(jià)體系的建立

2.1.2.1 綜合評分的計(jì)算 本試驗(yàn)采用綜合評分值作為乳膏劑處方篩選的指標(biāo)。采用外觀觀察、涂布性觀察反映乳膏劑的適用性，采用高溫試驗(yàn)、離心試驗(yàn)反映乳膏劑的物理穩(wěn)定性，同時(shí)還考察了對乳膏劑的適用性及物理穩(wěn)定性均有影響的均勻性、黏度及粒徑。預(yù)試驗(yàn)表明各樣品乳膏對高溫試驗(yàn)很敏感，且乳膏劑的穩(wěn)定性是評價(jià)乳膏劑質(zhì)量的重要指標(biāo)，故在綜合評分中賦予高溫試驗(yàn)結(jié)果的權(quán)重值為0.8;粒徑、黏度和離心試驗(yàn)也是影響乳膏穩(wěn)定性和適用性的主要因素，但樣品對三種指標(biāo)的敏感性較差，故在綜合評分中分別賦予的權(quán)重值為0.05;外觀、均勻性和涂布性主要影響乳膏適用性，但三者的測量誤差較大，樣品對三種指標(biāo)的敏感性較差，故在綜合評分中分別賦予三者的總權(quán)重值為0.05。從乳膏的穩(wěn)定性與適用性綜合考慮，并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果對樣品乳膏分別進(jìn)行外觀觀察、涂布性觀察、均勻性測定、黏度測定、粒徑測定、高溫試驗(yàn)、離心試驗(yàn)并按下式計(jì)算綜合評分。

2.1.2.2 外觀 肉眼觀察呈半固體狀，亮白，流動(dòng)性越小、細(xì)膩程度高、肉眼觀察無顆粒者分值越高。

2.1.2.3 涂布性 挑取乳膏少許涂于手背部皮膚，1 min內(nèi)能夠涂抹開吸收視為易于涂布，分值最高。

2.1.2.4 均勻性 肉眼觀察結(jié)果占50分，應(yīng)均勻無結(jié)塊;10×10倍鏡下觀察結(jié)果占50分，粒子應(yīng)無凝集，分五等（無凝集－，凝集+，凝集++，凝集+++，凝集++++），肉眼與鏡下觀察結(jié)果相結(jié)合計(jì)算總分。

2.1.2.5 黏度 于5 mL離心管裝滿待測乳膏，將4號轉(zhuǎn)子緩慢旋下置于乳膏中，以乳膏覆蓋至轉(zhuǎn)子刻度且不觸碰離心管壁為準(zhǔn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，待黏度計(jì)數(shù)顯屏數(shù)字不變化時(shí)讀取黏度。以200 Pa·s為滿分，100 Pa·s和300 Pa·s各為50分，黏度過大或過小分值遞減，黏度每變化2 Pa·s，分值變化1分。2.1.2.6 粒徑 參照《中國藥典》（2005版）二部附錄ⅨE粒度和粒度分布測定法第一法（顯微鏡法）測定粒度，先用1號測微尺對2號測微尺進(jìn)行標(biāo)定，觀察時(shí)用2號測微尺進(jìn)行粒徑測量，記錄讀數(shù)D，然后用標(biāo)定的結(jié)果將讀數(shù)D換算成微米，粒徑越小越好，50 μm為60分，每減少或增加1 μm則分值增加或減少1分。

2.1.2.7 高溫試驗(yàn) 于5 mL離心管填裝待測乳膏至刻度，置于藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中，調(diào)節(jié)溫度55℃恒溫保存6 h，乳膏無分層現(xiàn)象為滿分，分層體積越大分值越低，分層超過1 mL為0分。

2.1.2.8 離心試驗(yàn) 于5 mL離心管填裝待測乳膏至刻度，置于離心機(jī)中以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心0.5 h，乳膏無分層現(xiàn)象為滿分，分層體積越大分值越低，分層超過1 mL為0分。

2.1.3 均勻試驗(yàn)優(yōu)選鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏處方組成 預(yù)實(shí)驗(yàn)表明處方中的蜂蠟、司盤－60、吐溫－80為影響乳膏制劑外觀及穩(wěn)定性的主要影響因素，故采用U5（53）均勻試驗(yàn)優(yōu)選鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏處方組成。因素水平見表1，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

以綜合評分為評價(jià)指標(biāo)，采用沈陽藥科大學(xué)均勻設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行多元回歸處理，得回歸方程:Y=－107.379 0 + 37.810 0X2+ 178.196 2X3－46.453 1X23，復(fù)相關(guān)系數(shù) R2=0.999 9，s=0.384 4，回歸方程顯著性檢驗(yàn)F=1 013.945 5，方程顯著（P＜0.05）。優(yōu)化值為:X1=6.138，X2=1.128，X3=1.933，預(yù)測最大值為106.147，預(yù)測區(qū)間（104.898，107.397）。

2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用優(yōu)化處方用2.1.1項(xiàng)下方法制備三批乳膏，對樣品乳膏分別進(jìn)行外觀觀察、涂布性觀察、均勻性測定、黏度測定、粒徑測定、高溫試驗(yàn)、離心試驗(yàn)并進(jìn)行百分制評分，計(jì)算綜合評分，結(jié)果如表3。

表2 U5（53）均勻試驗(yàn)安排及結(jié)果

表3驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

三批乳膏綜合評分平均值為98.4±50，RSD（%）=0.51，說明優(yōu)選處方穩(wěn)定、合理、可行。

2.2 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏止癢藥效學(xué)研究

2.2.1 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏制備 按優(yōu)化處方采用“2.1.1”項(xiàng)下方法制備高、中、低劑量鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏，分別含鹽酸去氫駱駝蓬堿0.25%、0.5%、0.75%，備用。

2.2.2 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏對磷酸組胺所致皮膚瘙癢的影響［7］

2.2.2.1 動(dòng)物分組 昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，♀♂各半。模型對照組動(dòng)物只造模不用藥，陽性對照組用皮炎平軟膏0.003 75 mg/g，基質(zhì)組用空白基質(zhì)5 mg/g，試驗(yàn)藥物分3個(gè)劑量組:低劑量組0.012 5 mg/g、中劑量組0.025 mg/g、高劑量組0.037 5 mg/g。

2.2.2.2 磷酸組胺所致皮膚瘙癢動(dòng)物模型 用細(xì)砂紙打磨小鼠右后足背部皮膚，以皮膚發(fā)紅滲血不出血為度，抽取0.02%的磷酸組胺0.1 mL滴于打磨過的皮膚之上，立即觀察記錄15 min內(nèi)小鼠的瘙癢次數(shù)及持續(xù)時(shí)間。瘙癢指征為小鼠回頭舔啃右后足背皮膚;瘙癢持續(xù)時(shí)間間隔3 s以上記兩次次瘙癢，小于3 s記一次瘙癢。

2.2.2.3 試驗(yàn)方法 藥物組、陽性對照組、基質(zhì)組、涂抹于小鼠右后足背部皮膚并輕柔片刻至吸收，30 min后造模，觀察記錄15 min內(nèi)小鼠的瘙癢次數(shù)及持續(xù)時(shí)間。結(jié)果見表4。

表4 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏對磷酸組胺所致皮膚瘙癢的影響

2.2.3 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏對五羥色胺所致皮膚瘙癢的影響［7］

2.2.3.1 動(dòng)物分組 昆明種小鼠72只，隨機(jī)分為6組，每組12只，♀♂各半。模型對照組動(dòng)物只造模不用藥，陽性對照組用皮炎平軟膏0.003 75 mg/g，基質(zhì)組用空白基質(zhì)5 mg/g，試驗(yàn)藥物分3個(gè)劑量組:低劑量組0.012 5 mg/g、中劑量組0.025 mg/g、高劑量組0.037 5 mg/g。

2.2.3.2 5－羥色胺所致皮膚瘙癢動(dòng)物模型 吸取0.5 mg/mL的五羥色胺0.05 mL注射于小鼠右后足墊內(nèi)，立即觀察記錄1 h內(nèi)小鼠的瘙癢次數(shù)及持續(xù)時(shí)間，瘙癢指征為小鼠回頭舔啃右后足背皮膚;瘙癢持續(xù)時(shí)間間隔3 s以上記兩次次瘙癢，小于3 s記一次瘙癢。

2.2.3.3 試驗(yàn)方法 藥物組、陽性對照組、基質(zhì)組、涂抹于小鼠右后足背部皮膚并輕柔片刻至吸收，30 min后造模，觀察記錄1 h內(nèi)小鼠的瘙癢次數(shù)及持續(xù)時(shí)間。結(jié)果見表5。

表5 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏對五羥色胺所致皮膚瘙癢的影響

3 討論

3.1 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明單硬脂酸甘油酯和凡士林在不同的比例下均能制備出得分較高的乳膏，屬于非主要影響因素，故在均勻試驗(yàn)中將單硬脂酸甘油酯的用量固定為8%，凡士林用量固定為5%。

3.2 以往乳膏劑處方工藝篩選指標(biāo)多采用單一的穩(wěn)定性指標(biāo)或物理性能指標(biāo)，無法全面反映乳膏劑的穩(wěn)定性、工業(yè)化生產(chǎn)的可行性及使用的適應(yīng)性。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明采用單一指標(biāo)對乳膏進(jìn)行評價(jià)都是相對片面的，因此建立可用于乳膏劑處方篩選與工藝優(yōu)選的客觀評價(jià)指標(biāo)體系很有必要。本課題在進(jìn)行了大量預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上篩選出主要評價(jià)指標(biāo)，將主客觀評價(jià)指標(biāo)具體量化，并賦予不同權(quán)重，運(yùn)用綜合評分法建立了一套以相對客觀的穩(wěn)定性指標(biāo)（高溫與離心試驗(yàn)）、物理特性指標(biāo)（黏度、粒徑）為主，以外觀、涂布性等與乳膏使用密切相關(guān)的主觀指標(biāo)為輔的乳膏客觀評價(jià)指標(biāo)體系，用以全面評價(jià)各處方樣品乳膏。

乳膏劑是經(jīng)乳化而形成的非均相分散體系，熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)均不穩(wěn)定。因此在建立評價(jià)指標(biāo)體系時(shí)對乳膏劑的穩(wěn)定性進(jìn)行了細(xì)致的考察，結(jié)果表明各處方乳膏劑對高溫條件非常敏感，對離心試驗(yàn)較敏感，而對低溫環(huán)境不敏感，故低溫試驗(yàn)結(jié)果不計(jì)入綜合評分。同時(shí)試驗(yàn)還表明各處方乳膏劑對黏度、粒徑、外觀、涂布性較敏感。此外，客觀指標(biāo)較主觀指標(biāo)而言更為準(zhǔn)確，可信程度更高。因此結(jié)合指標(biāo)的敏感性與準(zhǔn)確性給各指標(biāo)賦予不同的權(quán)重值，驗(yàn)證試驗(yàn)也表明該綜合評分體系可以較好的評價(jià)乳膏劑質(zhì)量。

3.3 藥效試驗(yàn)結(jié)果表明就動(dòng)物瘙癢次數(shù)而言，基質(zhì)組與模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），對照組、高、中、低劑量的藥物組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示三個(gè)劑量的藥物及對照品對磷酸組胺、五羥色胺引起的瘙癢均有抑制作用，且藥物作用不受基質(zhì)的影響。其中藥物的高劑量組與陽性對照組止癢效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示藥物高劑量組減少瘙癢次數(shù)的作用優(yōu)于對照組。就動(dòng)物瘙癢持續(xù)時(shí)間而言，僅藥物的高劑量組與模型組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），其余組與模型組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。綜上所述鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏具有明顯的止癢作用，其中高、中劑量組減少瘙癢次數(shù)的效果優(yōu)于陽性對照組，但僅有高劑量組可顯著縮短動(dòng)物的瘙癢時(shí)間。

3.4 參考文獻(xiàn)［7］的實(shí)驗(yàn)條件并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果制作磷酸組胺所致皮膚瘙癢動(dòng)物模型與5－羥色胺所致皮膚瘙癢動(dòng)物模型。磷酸組胺與5－羥色胺均為導(dǎo)致瘙癢的炎性介質(zhì)。磷酸組胺所致皮膚瘙癢動(dòng)物模型致癢作用穩(wěn)定迅速，觀察時(shí)間短，操作簡單，可以作為快速考察藥物止癢作用的動(dòng)物模型。5－羥色胺模型致癢作用相對緩慢，但致癢時(shí)間長，可與磷酸組胺模型結(jié)果結(jié)合說明藥物的止癢作用。

致謝:新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司給予本課題大力支持。

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