馮素香， 王淑美， 梁生旺， 李建生

（1.河南中醫(yī)學院，河南鄭州 450008;2.廣東藥學院，廣東廣州 510006）

腦脈通由大黃、葛根、人參等藥物組成，具有解毒降濁、益氣活血作用，治療老年腦梗死具有明顯效果，對腦缺血再灌注損傷有明顯保護作用［1］。中藥復方是由多種中藥材組成的，復方中藥與各味原藥材的成分之間一定存在著相關性。中藥指紋圖譜是用于中藥質量控制的標準之一，在指紋圖譜研究中研究復方中藥與中藥材的相關性，有利于制定科學的復方中藥質量控制方法。本研究采用HPLC-PDAD聯用方法，建立了腦脈通有效部位HPLC指紋圖譜，并對有效部位化學成分指紋圖譜色譜峰的歸屬進行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津），SPDM10Avp二極管陣列檢測器（日本島津）;BSZZ4S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試藥 乙腈為色譜純;純凈水，磷酸、乙醇、正丁醇等試劑均為分析純。

大黃、人參、葛根等藥材購自河南省藥材公司，經河南中醫(yī)學院陳隨清教授鑒定分別為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.的干燥根及根莖、五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根、豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根。腦脈通有效部位樣品（自制）。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

按處方量稱取葛根、大黃、人參等藥材，用70%乙醇提取兩次，每次1 h，回收乙醇至無醇味，水溶液過大孔吸附樹脂柱，先用蒸餾水洗至無色，再用低濃度乙醇洗去雜質，繼用A%濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇至干，并于60℃低溫烘干，即得到有效部位（此部位是經藥效學實驗篩選出來的）［2，3］。

取有效部位樣品0.3 g，精密稱定，加水20 mL超聲使溶解，轉移至分液漏斗中，用水飽和正丁醇提取4次（20，20，15，15），合并正丁醇液，水浴上蒸干，殘渣加甲醇使溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，作為有效部位供試品溶液。

藥材供試品溶液的制備:按處方量分別稱取各藥材，按有效部位相同制備方法處理。

陰性復方供試品溶液的制備:按處方量稱取除某味藥的陰性處方，按復方相同制備方法處理。

2.2 色譜條件

色譜柱:Sinochrom ODS-BP C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）（大連依利特）;流動相:乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）梯度洗脫（B%為96→90→80→60→96，相應時間周期為0→60→80→120→140 min）;流速:1.0 mL/min;檢測波長:203 nm;柱溫:30℃。吸取供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，測定120 min的色譜圖。

2.3 方法學考察［4］

2.3.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，在203 nm波長進行檢測，記錄各色譜峰的保留時間和峰積積分值，計算各共有峰相對參照峰（8號色峰）的相對保留時間和相對峰面積。結果，共有峰相對保留時間的RSD為0～1.91%，相對峰面積的RSD為0～2.69%。結果表明，儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件分別在制備后 0、3、6、9、12、18、24 h 進樣，記錄各色譜峰的保留時間和峰面積積分值，計算各共有峰相對參照峰（8號色峰）的相對保留時間和相對峰面積。結果，共有峰相對保留時間的RSD為0～1.72%，相對峰面積的RSD為0～1.84%。結果表明，供試品溶液在24 h檢測時間范圍內基本一致，表明樣品溶液在24 h內基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 取同一批樣品，按供試品方法重復制備6個供試品溶液，精密吸取供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件分別進行測定，記錄各色譜峰的保留時間和峰面積積分值，計算各共有峰相對參照峰（8號色峰）的相對保留時間和相對峰面積。結果，共有峰相對保留時間的RSD為0～1.86%，相對峰面積的RSD為0～2.42%。結果表明重復性基本符合指紋圖譜要求。

2.4 有效部位指紋圖譜的建立及特征峰的標定

按上述方法制備供試品溶液，按上述梯度洗脫條件進行色譜分析，獲得全方有效部位以及組方藥材的指紋圖譜。經比較，全方有效部位在203 nm標注了36個共有色譜峰作為可以構成有效部位指紋圖譜的穩(wěn)定特征峰（指紋圖譜見圖1）。其中0～24 min主要為未知小峰，tR=25.16 min最高峰為葛根素色譜峰，25～30 min為葛根中黃酮類成分，在203 nm檢測波長下22號峰為人參皂苷Rg1，其后面的肩峰為人參皂苷Re，31號峰為人參皂苷Rb1。其它色譜峰多來源于大黃中成分。各藥材相應部位的指紋圖譜見圖2。

圖2 藥材HPLC圖譜（203 nm）

2.5 有效部位與藥材指紋圖譜相關性分析

分析大黃藥材的供試品與有效部位色譜圖，其中有5個保留時間一致和紫外吸收光譜圖很相似的色譜峰（見圖3）;人參藥材的供試品與有效部位有3個保留時間一致的色譜和紫外吸收光譜圖很相似峰（見圖4）;葛根藥材的供試品與有效部位有5個保留時間一致的色譜和紫外吸收光譜圖很相似峰（見圖5）。

圖3 有效部位與大黃藥材圖譜（203 nm）（A有效部位 B大黃陰性 C大黃藥材）

圖4 有效部位與人參藥材圖譜（203 nm）（A有效部位 B人參陰性 C人參藥材）

圖5 有效部位與葛根藥材圖譜（203 nm）（A有效部位 B葛根陰性 C葛根藥材）

綜合有效部位與各原藥材的相關性研究，在203 nm波長檢測下共找出與原藥材色譜峰保留時間一致的色譜峰14個。見表1。

表1有效部位與各原藥材指紋圖譜中對應峰（203 nm）

研究結果表明，有效部位成分主要來自人參、葛根和大黃等三味藥材，含有葛根素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1等成分，含量測定分析結果顯示，有效部位中黃酮類、皂苷類和蒽醌類占主要部分［5，6］。

3 討論

3.1 洗脫條件的選擇 腦脈通有效部位中含有多種化學成分，如葛根中黃酮類成分、人參中皂苷類成分、大黃中蒽醌類成分等多種活性物質，成分較為復雜，很難找到較為理想的等度洗脫條件。研究中我們分別采用了乙腈-水、乙腈－0.01%磷酸水、乙腈－0.05%磷酸水、乙腈－0.1%磷酸水等多種不同濃度和比例的等度及梯度洗脫條件進行了試驗，結果發(fā)現采用乙腈－0.1%磷酸水進行梯度洗脫，各色譜峰分離結果良好。

3.2 檢測波長的選擇 人參中皂苷類成分為末端吸收，故選取203 nm作為測定波長，在此條件下能全部表達腦脈通有效部位中全部化合物的色譜峰;同時各組分也可以得到較好的分離。

3.2 參照物的確定 腦脈通處方由葛根、大黃、人參、川芎等藥材組成。其中人參中人參皂苷紫外吸收為末端吸收，靈敏度較低;主要鑒于指紋圖譜的目的是甄別原料和藥品的真?zhèn)?，為此，我們認為選定葛根中含量高、靈敏度高的葛根素為本指紋圖譜技術要求的參照物，葛根素也是中國藥品生物制品檢定所確認的黃酮苷類標準物質之一。

3.3 組方藥材與有效部位相關性的分析 本論文研究腦脈通有效部位與各味藥材相關性的方法是:在同一色譜條件下分析有效部位、藥材、部分對照品及陰性對照色譜圖，如果某色譜峰在藥材色譜圖中出現，而在陰性對照色譜圖的對應保留時間上缺失，則提示該色譜峰來源于該藥材;如果該色譜峰在有效部位色譜圖中也同時出現，且來自于有效部位的某色譜峰與某原藥材的色譜峰的紫外吸收光譜相似，即表示有效部位中的這個色譜峰就來自于這味藥材。采用對照品對色譜圖中的有關峰進行了指認。

通過對腦脈通有效部位指紋圖譜與各藥材相應部位指紋圖譜的相關性分析，闡明了有效部位中主要指紋峰的來源。本研究結果將為腦脈通新藥研發(fā)的工藝和質控研究奠定了基礎，充分顯示出色譜指紋圖譜技術在中藥分析質控難題的核心技術應用前景。

［1］任小巧，李建生，封銀曼，等.腦脈通對老齡大鼠腦缺血/再灌注損傷腦保護作用的研究［J］.中國中藥雜志，2004，29（1）:66-68.

［2］王淑美，馮素香，郭亞健，等.腦脈通不同提取工藝中蒽醌類化學成分變化的研究［J］.中成藥，2007，29（4）:511-515.

［3］王淑美，馮素香，梁生旺，等.反相高效液相色譜法測定腦脈通有效部位中蒽醌類成分的含量［J］.中國新藥與臨床雜志，2007，26（3）:171-174.

［4］國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）［J］.中成藥，2000，22（10）:391.

［5］王淑美，李淑芳，梁生旺，等.AB-8大孔吸附樹脂純化復方腦脈通有效部位的工藝研究［J］.中成藥，2009，31（1）:47-50.

［6］王淑美，馮素香，李淑芳，等.腦脈通有效部位中總蒽醌的含量測定［J］.廣東藥學院學報，24（2）:128-129.