卓 越， 王新春， 甘永祥， 張 華， 邊海旭， 陳 文

（1.教育部省部共建新疆特種植物藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002;2.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院一附院，新疆石河子 832008;3.武警新疆森林總隊(duì)，新疆烏魯木齊 830013）

甘草中的黃酮類成分是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［1］。其中甘草苷、異甘草苷、甘草素及異甘草素是甘草中的4種重要黃酮類化合物，近年研究發(fā)現(xiàn)甘草苷、異甘草苷、甘草素及異甘草素是抗HIV的有效成分，對(duì)其提取分離工藝和臨床研究日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視［2］。

目前，用高效液相色譜法測(cè)定天然產(chǎn)物中甘草黃酮類化合物已有文獻(xiàn)報(bào)道［3-7］，但主要是測(cè)定甘草及其產(chǎn)品中的其中2種或3種成分含量。對(duì)這4種黃酮類化合物含量的同時(shí)測(cè)定，尤其是對(duì)甘草苷、異甘草苷、甘草素及異甘草素的同時(shí)測(cè)定尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定甘草中4種黃酮類化合物的高效液相色譜法，簡(jiǎn)便、快捷、重現(xiàn)性好。

1 儀器與材料

Waters高效液相色譜儀，Delta 600泵，2996型DAD二極管陣列紫外檢測(cè)器（美國(guó)沃特斯公司）;Sartorius BP211D型電子天平（美國(guó)）;TP300超聲波提取器（北京天鵬電子新技術(shù)有限公司）;EZM505201冷凍干燥儀（Crawley England）;乙腈（色譜純），自制雙蒸水，其余試劑均為分析純。

甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）;甘草購(gòu)于新疆石河子市一附院藥劑科，由石河子大學(xué)藥學(xué)院成玉懷高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 甘草總黃酮提取純化與富集 甘草95%乙醇回流提取液濃縮成稠膏狀，石油醚、乙酸乙酯依次萃取3次，乙酸乙酯萃取液用5%Na2CO3和濃鹽酸堿提酸沉后，再用乙酸乙酯萃取并減壓濃縮，60℃恒溫干燥至恒量得棕黃色甘草總黃酮類化合物。將其配成1.5 mg/mL的藥液，pH值調(diào)至5.0，以3 mL/min速度的上樣使AB-8型大孔吸附樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和，80%的乙醇溶液洗脫。洗脫液濃縮、冷凍干燥得總黃酮含量為53.15%微黃色粉末備用。

2.2 甘草總黃酮樣品液的制備 精密稱取甘草總黃酮的凍干粉末2.03 mg于10 mL量瓶中，甲醇定容搖勻，即得。

2.3 對(duì)照液的制備 精密稱取甘草苷10.42 mg、異甘草苷8.88 mg、甘草素2.78 mg、異甘草素3.07 mg分別于25 mL量瓶中，甲醇定容搖勻，即得。

2.4 色譜條件［3-7］色譜柱:HC-C18ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相A為0.04%甲酸溶液，B為乙腈，作梯度洗脫，梯度洗脫條件:0～15 min，B%為25% ～35%;15～40 min，B%為35%;檢測(cè)波長(zhǎng)為292 nm，柱溫為室溫，流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為20 μL。

2.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇［3-7］甘草苷、異甘草苷、甘草素及異甘草素都屬于黃酮類化合物，母核相同，性質(zhì)相似，經(jīng)DAD檢測(cè)器檢測(cè)在292 nm處4種黃酮類化合物對(duì)照品各峰面積比例適中且均有較高的響應(yīng)值。見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品在292 nm處的圖譜

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［4］分別精密吸取4種對(duì)照液甘草苷120 μL、甘草素 34 μL、異甘草苷 110 μL、異甘草素 39 μL 于10 mL量瓶中。再分別精密吸取這4種對(duì)照液起始體積的2、3、4、5、6、7、8、9 倍，并分別注入各量瓶中，甲醇定容搖勻。精密吸取各濃度的混合對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按照2.4項(xiàng)下方法測(cè)定各濃度對(duì)照品峰面積，其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為:甘草苷y=57 623x－16 755，r2=0.999 3;異甘草苷y=53 892x－6 369.6，r2=0.999 1;甘草素y=348 900x+8 458.4，r2=0.999 8;異甘草素y=138 884x+27 344，r2=0.999 4。甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素的線性范圍分別為 5 ～36 μg/mL，3 ～28 μg/mL，0.3 ～2.7 μg/mL 和0.4 ～3.4 μg/mL。

2.7 精密度試驗(yàn)［6］精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各自的峰面積，計(jì)算得甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素對(duì)應(yīng)的RSD分別為1.05%、2.27%、2.64%和1.55%，表明該方法精密度良好。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)［6］取甘草樣品6份，按2.2項(xiàng)下方法制備甘草乙醇提取液，平行進(jìn)樣2次，按2.4項(xiàng)下方法測(cè)定，并用外標(biāo)法計(jì)算，甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素對(duì)應(yīng)的RSD分別為0.31%、2.12%、2.67和3.11%，表明此方法重現(xiàn)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)［6］精密吸取同一供試品溶液，分別在4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣 20 μL，測(cè)定甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素含量，其對(duì)應(yīng)的RSD分別為1.03%、1.25%、2.46和3.01%（n=6）。

2.10 加樣回收實(shí)驗(yàn)［6］分別取甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素對(duì)照品適量，加入到已知含量的甘草粉末中，按2.2項(xiàng)下供試品液的制備方法制備樣品，測(cè)定4種黃酮類化合物的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定甘草總黃酮凍干粉末中四類黃酮類化合物的含量:乙醇提取液在292 nm處的圖譜如圖2所示。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中甘草苷為27.72%，異甘草苷為10.87%，甘草素為0.17%，異甘草素為0.01%。樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

由含量測(cè)定結(jié)果可以看出，甘草原材料經(jīng)純化富集后，甘草苷和異甘草苷的含量較高而苷元甘草素和異甘草素的含量相對(duì)較低，說(shuō)明這種純化方法不適合于富集苷元。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)酸水解法可以通過(guò)水解苷的方式明顯提高甘草中苷元的含量［7］，但會(huì)減少苷的含量，對(duì)同時(shí)提高苷和苷元含量不利。

現(xiàn)有文獻(xiàn)在測(cè)定甘草黃酮類化合物3種或3種以上尤其在同時(shí)測(cè)定其中的苷和苷元時(shí)多采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)［4，6］，或者在梯度洗脫時(shí)間變換同時(shí)變換檢測(cè)波長(zhǎng)［8］，操作較復(fù)雜，使重現(xiàn)性較差。本試驗(yàn)采用在同一檢測(cè)波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)出4種黃酮類化合物，大大簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，提高了精密度和靈敏度，重現(xiàn)性良好。

本試驗(yàn)分別考察了甲醇-水，乙腈-水（0.5%醋酸），乙腈-水（0.04%甲酸）等體系進(jìn)行洗脫，結(jié)果以乙腈-水（0.04%甲酸）體系進(jìn)行小范圍梯度洗脫得到的色譜峰形較好，且相對(duì)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中將4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品等體積混合進(jìn)樣得出4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的混合圖譜，同時(shí)測(cè)定甘草中甘草苷、異甘草苷、甘草素及異甘草素的含量，簡(jiǎn)化了甘草黃酮類化合物含量測(cè)定，為其指紋圖譜的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖2 甘草乙醇提取液在292 nm處的圖譜

［1］張 波，劉會(huì)洲，官月平，等.烏拉爾甘草中黃酮類化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］.中成藥，2006，28（9）:1362-1365.

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